农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究

摘要

改变植物性状表现，转基因是最直接有效的手段。植物遗传转化方法有很多，农杆菌介导法由于其可以转入的片段长、拷贝数少、遗传稳定性好等优点，长期以来一直是科学工作者重点研究的方法。本研究利用玉米优良自交系齐319和R18-599为材料，对农杆菌介导的胚性愈伤遗传转化体系进行了一系列优化；同时分别从玉米和烟草中分离到两段启动子序列Zm13和NTPp13，分别验证了其花粉特异表达特性；将来源于玉米的花粉特异表达启动子序列Zm13与来源于大肠杆菌的脱乙酰酶基因(argE)连接，构建雄性不育嵌合基因，转化玉米自交系齐319，以期获得玉米基因工程雄性不育系，为玉米杂种优势利用创建基础材料。主要结果如下： 1.玉米胚性愈伤遗传转化体系优化实验结果显示，在侵染液中添加0.1％的Tween20、侵染液浓度OD600为0.4、侵染时间为10min，共培养培养基中添加200μM乙酰丁香酮、200mg/L的L-半胱氨酸，共培养温度22℃、pH值5.2有利于玉米胚性愈伤的遗传转化。 2.用三种不用类型的农杆菌菌株C58、LBA4404和EHA105分别侵染玉米自交系齐319和RR18-599胚性愈伤。结果显示，不同的菌株和自交系间的搭配，其遗传转化效率差异很大，GUS瞬时表达率呈极显著差异(F=24.92**)，抗性愈伤率也呈极显著差异(F=19.43**)。EHA105-齐319组合的遗传转化效率最高，其GUS瞬时表达率最高达到71.1％，最低为37.1％，平均55.5％；其抗性愈伤率最高为20％，最低为10.8％，平均14.4％。另外，对胚性愈伤的抗性筛选时，潮霉素临界浓度以10mg/L为宜。 3.对转GUS基因的T0代抗性植株进行PCR检测，结果显示，在22株再生抗性植株中，PCR阳性率50％，对PCR阳性植株叶片进一步组织化学染色分析显示，PCR阳性植株中均有GUS基因表达。从而证明，外源GUS基因在转基因玉米T0代植株中得到稳定表达，而且验证了PCR检测结果和GUS表达分析结果的一致性。 4.从玉米自交系RR18-599基因组中分离到一段花粉特异表达启动子序列Zm13，将该启动子片段与GUS基因融合后转化烟草，经组织化学分析证实分离到的Zm13启动子片段具有花粉特异表达功能，为进一步创建基因工程雄性不育系奠定基础。 5.从烟草中克隆到一段核甘酸序列NTPp13，与玉米花粉特异表达启动子Zm13序列相似性为96％，而且具有和Zm13启动子完全保守的TATAbox、花粉特异表达元件和表达量增强元件。将该序列与GUS基因连接后转化烟草，在转基因烟草植株中分析功能、特异表达部位及时空表达特性，结果显示NTPp13序列是烟草中与花粉发育相关的一段启动子序列，该启动子引导GUS基因只在烟草花粉和花粉管中表达，在其它组织部位不表达。而且随着花粉粒的成熟，表达活性增强；进一步研究发现，该启动子的活性不受温度调控。序列比对结果显示，对该启动子的研究以前尚未有过报道。研究证明，NTPp13序列很可能是烟草中与花粉发育相关基因的启动子区域。 6.从大肠杆菌JM101基因组中分离到脱乙酰酶基因argE，根据该基因可以将对植物无毒性的化学物质N-乙酰-草丁膦的乙酰基去除，生成毒性物质草丁膦的原理，构建玉米雄性不育系。将argE基因与玉米花粉特异启动子Zm13连接，转化玉米自交系齐319，对抗性植株分子检测，证实雄性不育嵌合基因已经整合到玉米基因组中，为进一步创建雄性不育系奠定理论基础。

目录

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英文缩写与中英文扩展名

第一部分文献综述1玉米遗传转化研究综述

第一部分文献综述2植物启动子研究概况

第一部分文献综述3基因工程创建雄性不育系研究概况

第二部分研究内容第一章农杆菌介导的玉米胚性愈伤的遗传转化研究

第二部分研究内容第二章玉花粉特异表达启动子Zm13的分离及功能鉴定、烟草花粉特异表达启动子序列NTPp13的分离、结构特征及时空表达分析

第二部分研究内容第三章基因工程创建玉米雄性不育系的初步研究

参考文献

致谢