玻璃化冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的研究

摘要

本实验对影响玻璃化冷冻保存小鼠GV期卵母细胞效果的几个因素进行了研究，如冻前预处理方法、卵母细胞形态、冷冻方法、解冻方法、基础液、胎牛血清浓度等，目的在于筛选适合超低温冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的冷冻程序。研究结果如下： 1. 对小鼠Gv期裸卵进行不同的冻前预处理，用0PS法冷冻保存，解冻后继续培养成熟，进行体外受精，根据卵裂率分析不同平衡方法对小鼠卵母细胞的毒性作用。结果表明，用EFS40一步法处理0.5min、imin、2min、3min后的卵裂率分别为7.35％、17.02％、12.12％、4.44％；将卵母细胞用EFS20处理O.5min、1min、2min、3min，再移入EFS40处理0.5min后，卵裂率分别为9.15％、10.08％、30.95％、12.41％。表明二步法优于一步法。预处理最佳组合为EFS20(2min)+EFS40(0.5min)。 2. 将完整的卵丘一卵母细胞复合物和用吸管吹掉卵丘的裸卵分别进行玻璃化冷冻，培养成熟后体外受精，卵裂率分别是23.17％、30.96％，差异不显著(P>0.05)。两者都与未经冷冻保存的对照组(60.00％)有极显著差异(P<0.01)。 3. 分别用straw法、OPS法、GMP法冷冻保存GV期卵母细胞，结果显示，OPS法(33.07％)与GMP法(33.85％)差异不显著(P>0.05)，GMP法略优于OPS法，两者与Straw法(10.37％)存在极显著差异(P<0.01)。三种冷冻方法与未经冷冻保存的对照组(60.00％)存在极显著差异(P<0.01)。 4. 分别用一步法、二步法和三步法对OPS法冷冻保存的GV期卵母细胞进行解冻，表明二步法解冻(33.62％)和三步法解冻(35.55％)卵裂率极显著优于一步法解冻卵裂率(12.50％)(P<0.01)，二步法解冻(33.62％)与三步法解冻(35.55％)卵裂率差异不显著(P>0.05)。 5. 分别用DMEM和DPBS作为玻璃化冷冻液的基础液，对GV期小鼠裸卵进行玻璃化冷冻保存，结果表明，用DMEM(31.25％)或DPBS(30.28％)作为玻璃化冷冻液的基础液效果差异不显著(P>0.05)。 6. 在玻璃化液中添加不同浓度的胎牛血清的试验显示，玻璃化冷冻液中添加20％胎牛血清效果(33.58％)与不添加胎牛血清效果(6.92％)差异极显著(P<0.01)，与添加10％胎牛血清效果(21.09％)差异显著(O.OI0.05)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分文献综述：哺乳动物卵母细胞冷冻保存的研究进展

1哺乳动物卵母细胞冷冻保存的原理

2哺乳动物卵母细胞冷冻保存的历史

3哺乳动物卵母细胞冷冻保存的现状

4影响哺乳动物卵母细胞冷冻效果的因素

5冷冻保存对哺乳动物卵母细胞的影响

6展望

第二部分试验研究：玻璃化冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的研究

1试验材料

1.1试验动物

1.2试验仪器及药品

2试验方法

2.1卵子的准备

2.2卵母细胞的冷冻及解冻

2.3解冻后的卵母细胞体外成熟培养

2.4精子的准备

2.5体外受精

3数据分析

4结果

4.1玻璃化冷冻前不同预处理对对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

4.2卵母细胞形态对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

4.3冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

4.4解冻方法对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

4.5基础液对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

4.6胎牛血清浓度对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5讨论

5.1玻璃化冷冻前不同预处理对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5.2卵母细胞形态对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5.3冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5.4解冻方法对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5.5基础液对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

5.6胎牛血清浓度对小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果影响

6结论

参考文献

致谢

附图

附表

攻读学位期间发表的论文