虎杖愈伤组织的诱导及提高白藜芦醇含量的初步研究

摘要

虎杖(Polygonbun Cuspidatum Sieb et zucc)为蓼科萝属多年生草本植物，为常用中药。其主要活性成分白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然抗毒素，是目前研究较为热门而被认为是最有希望的天然化学防癌剂之一。本文以虎杖地上茎和叶为材料，诱导愈伤组织，建立了离体无性繁殖系，研究了愈伤组织中白藜芦醇的提取工艺，不同外植体、培养基、光照强度及前体物质对愈伤组织的生长和白藜芦醇含量的影响。主要研究结果如下： 1.用正交实验研究了溶剂种类、时间、温度对白藜芦醇提取率的影响，极差分析结果显示，提取温度是提取工艺过程中最重要的因素，其次是提取时间，而提取溶剂对白藜芦醇提取率的影响最小。综合评价各指标，用乙酸乙酯在4℃下提取48 h效果最佳，虎杖愈伤组织中白藜芦醇的产量可达到13.241 μg·g<'-1>。 2.通过研究外植体和培养基对愈伤组织的影响，了解到以茎段作为外植体时诱导出的愈伤组织生长比叶片快，且其中的白藜芦醇含量为叶片中的5倍；MS培养基上的愈伤组织增殖最多，其茎段和叶片的鲜重增长率均极显著高于N6和B5培养基，分别达到了141.0％和73.8％，但白藜芦醇含量略低于B5培养基。因此，以MS为基本培养基，虎杖茎段为外植体诱导出的愈伤组织成愈较高，生长旺盛，维持时间长，白藜芦醇含量高，优于其他处理。 3.将茎段诱导出的愈伤组织，分别于暗光(0 1x)、弱光(1340～1560 1x)、强光(3110～3310 1x)三个条件下进行培养，结果显示，愈伤组织的生物量随着光照强度的增强而增加，强光培养下愈伤组织的生物量达到了53.682 g·L<'-1>FW，较暗光下高2596，但仅比弱光下高出0.4％。白藜芦醇含量与光照强度未成正相关，弱光培养下，愈伤组织中自藜芦醇的含量显著高于另外两个处理，为140.074μg·g<'-1>DW。可见，虎杖愈伤组织对光敏感，以弱光培养效果最好。 4.添加10～30 mg·L<'-1>浓度的前体物质苯丙氨酸后能促进愈伤组织生物量的增殖，且表现为20 mg·L<'-1>处理下生物量增殖最多。用Richards方程模拟了愈伤组织的生物量在一个生长周期内的动态积累过程，发现在不加前体物质的情况下，可以得到稳健、可靠的估计，前体物质在一定程度上调节了愈伤组织的增长情况。由生长速率参数(K)可知，随着苯丙氨酸浓度的增加，愈伤组织增长速度加快，极显著高于对照，高出16.5倍以上。 5.添加前体物质苯丙氨酸能诱导苯丙氨酸裂解酶活性的增高。各处理的PAL活性的变化趋势基本一致，都在培养的第7 d达到最大值，PAL的活性表现出随着添加的苯丙氨酸浓度的增大而升高，A3处理达到最大值，为97.0 RU·g<'-1>FW，较CK高出81.6％，A2处理较CK高出75.6％，仅A1处理低于CK，与其他处理达到极显著差异。7d后，苯丙氨酸裂解酶活性迅速下降，并不再回升6添加前体物质苯丙氨酸对愈伤组织中的可溶性蛋白含量无显著的影响。在一个生长周期内，可溶性蛋白在第14 d～21 d出现最大值，各处理间未达到显著性差异。7添加适量的前体物质能延缓虎杖愈伤组织细胞的衰老，增加愈伤组织的抗性。虎杖愈伤组织中的MDA含量随着培养时间的增长而增加，在达到最大值时，添加前体物质后，各处理的丙二醛含量显著低于对照。虎杖愈伤组织中可溶性糖含量的变化趋势是随着培养时间的增加而增加，表现为A3>A1>CK>A2，处理间达到显著或极显著差异。8愈伤组织中的白藜芦醇含量随着苯丙氨酸浓度的增加而增加，A3处理下，白藜芦醇的含量达到最大值，鲜样、干样中分别为18.025μg·g<'-1>和241.489μg·g<'-1>，较对照高出16.8％和5.7％。各处理愈伤组织中的白藜芦醇含量在生长周期内呈现出先升高后降低的趋势，且白藜芦醇峰值的出现时间均在第21d。由此可以看出，以白藜芦醇含量为标准，虎杖愈伤组织的最佳收获时间是21d左右。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略符号与中英文对照表

声明

1绪论

1.1前言

1.2虎杖的生物学特性及药用价值

1.3白藜芦醇国内外研究现状

1.3.1物理化学性质

1.3.2测定方法

1.3.3代谢途径

1.3.4白藜芦醇的化学合成

1.3.5有关提高白藜芦醇含量的研究

1.3.6白藜芦醇的药用效果

1.4虎杖中白藜芦醇的研究现状

1.5植物细胞培养中次生物质形成的影响因素和调节因素

1.5.1愈伤组织中次生代谢物形成的影响因素

1.5.2愈伤组织中次生代谢物合成的调节因素

1.6本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验设计

2.2.1虎杖无菌体系的建立

2.2.2虎杖愈伤组织中白藜芦醇提取工艺部分参数的确定

2.2.3不同光照强度对虎杖愈伤组织的影响

2.2.4添加不同浓度的前体物质苯丙氨酸对虎杖愈伤组织的影响

2.3调查测定项目与方法

2.3.1愈伤组织的生长调查

2.3.2愈伤组织中白藜芦醇含量的测定

2.3.3苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性的测定

2.3.4可溶性蛋白含量的测定

2.3.5丙二醛(MDA)和可溶性糖含量的测定

2.4数据分析与处理

3结果与分析

3.1虎杖愈伤组织中白藜芦醇提取工艺部分参数的确定

3.2不同外植体和培养基对虎杖愈伤组织的影响

3.2.1对愈伤组织成愈率的影响

3.2.2对愈伤组织生长情况的影响

3.3.3对愈伤组织中白藜芦醇含量的影响

3.3不同光照强度对虎杖愈伤组织的影响

3.3.1对愈伤组织成愈率的影响

3.3.2对愈伤组织生物量的影响

3.3.3愈伤组织的形态

3.3.4对愈伤组织中白藜芦醇含量的影响

3.4添加不同浓度前体物质苯丙氨酸对虎杖愈伤组织的影响

3.4.1对虎杖愈伤组织生物量的影响

3.4.2对苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性的影响

3.4.3对可溶性蛋白含量的影响

3.4.4对MDA和可溶性糖的影响

3.4.5对白藜芦醇含量的影响

4讨论

4.1虎杖愈伤组织中白藜芦醇提取工艺部分参数的确定

4.2外植体和培养基与愈伤组织形成的关系

4.3光照与愈伤组织形成的关系

4.4添加前体物质与虎杖愈伤组织的关系

4.4.1能促进愈伤组织的生长

4.4.2能促进苯丙氨酸裂解酶活性的提高

4.4.3与可溶性蛋白含量的关系

4.4.4增加愈伤组织的抗性，延缓衰老

4.4.5促进白藜芦醇含量的增加

5结论

参考文献：

附图

致谢

硕士期间发表论文