小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

摘要

本研究分别使用细管法和0PS法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚和囊胚，并使用含有0.5M蔗糖的DPBS液一步稀释法解冻保存卜6d的胚胎，使用添加10％胎牛血清(FCS)的TCMl99培养液培养24h或将解冻后的胚胎移植入受体子宫，观察了胚胎的解冻后体外发育能力和移植后受体妊娠率和产仔率，以此讨论小鼠桑椹胚和囊胚玻璃化冷冻的最佳方法和发育阶段。试验结果表明： 1、使用一步法玻璃化冷冻，当胚胎在EFS40中平衡0.5min，解冻后使用TCMl99培养24h，桑椹胚的囊胚化率为70.59％,而囊胚则仅有41.94％在解冻后继续发育。胚胎在EFS40中平衡1.0min，桑椹胚和囊胚解冻后体外发育率分别为52.27％，50.00％。使用两步法玻璃化冷冻，胚胎先在EFS20中平衡2.0min，然后在EFS40中平衡0.5min，解冻后桑椹胚经24h培养后囊胚化率为81.13％，极显著高于囊胚的扩张率(48.94％)(P<0.01)。两步法冷冻在EFS40中平衡1.0min，解冻后桑椹胚的囊胚化率和囊胚的扩张率分别为75.00％，45.00％。 2、胚胎移植入受体后，桑椹胚鲜胚和两步法冷冻桑椹胚的妊娠率分别为42.86％和28.57％。两步法冷冻胚胎，胚胎先在EFS20中平衡2.0min，然后在EFS40中平衡1.0min，无论桑椹胚还是囊胚移植后均未获得妊娠受体。两步法冷冻，胚胎先在EFS20中平衡2分钟，然后在EFS40中平衡0.5min，桑椹胚在解冻移植后产仔率(11.11％)显著高于囊胚(4.11％)(P<0.05)。两步法冷冻桑椹胚移植后妊娠率(28.57％)和产仔率(11.11％)显著高于一步法(14.29％，3.80％)(P<0.05)。 3、一步法处理桑椹胚，胚胎在EFS40中平衡0.5 min，经24h培养后囊胚化率为72.31％，显著高于在EFS40中平衡1.0 min的桑椹胚(47.62％)，与桑椹胚鲜胚(81.54％)相比差异不显著(P>0.05)。一步法处理囊胚，胚胎在EFS40中平衡0.5min，经24h培养后扩张率为25.00％，极显著低于桑椹胚(47.62％)和鲜胚(81.54％)的扩张率(P<0.01)。两步法处理桑椹胚，胚胎先在EFS20中平衡2分钟，然后在EFS40中平衡0.5 min，经24h培养后囊胚化率为81.43％，极显著高于囊胚(46.15％)的扩张率(P<0.01)。 4、一步OPS法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚获得了96.83％的囊胚化率，与一步细管法(90.16％)相比差异不显著(P>0.05)。桑椹胚的一步细管法和一步OPS法囊胚化率(90.16％，96.83％)均显著高于囊胚的扩张率(77.36％，56.36％)(P<0.05，P<0.01)。两步OPS法玻璃化冷冻小鼠囊胚体外培养24h后扩张率达到71.15％，显著高于两步细管法(P<0.05)。两步OPS法和两步细管法冷冻小鼠桑椹胚，囊胚化率分别为93.44％和96.72％，两者间无显著差异。 5、使用OPS两步细管法冷冻桑椹胚，胚胎在EFS40中平衡0.5min，解冻移植后受体妊娠率(42.86％)和产仔率(12.35％)均显著高于一步法冷冻桑椹胚(2.53％)和在EFS40中平衡lmin桑椹胚(3.57％)(P<0.01)。两步法冷冻，胚胎在EFS40中平衡0.5 min，囊胚解冻移植后受体妊娠率(28.57％)和产仔率(5.48％)显著低于桑椹胚(42.86％，12.53％)(P<0.05)。

目录

文摘

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论文说明：符号说明

声明

第一部分文献综述

1.胚胎玻璃化冷冻保存原理

2.玻璃化溶液常用的几类抗冻保护剂

2.1渗透性保护剂

2.2非渗透性保护剂

2.3抗冻蛋白

3.玻璃化溶液的组成

4.胚胎玻璃化冷冻保存的方法

4.1按照预处理方法分

4.2按照冷冻载体分

5.解冻和抗冻保护剂的脱除

5.1胚胎的解冻

5.2抗冻保护剂的脱除

6.应用前景及存在问题

6.1濒危动物、实验动物的保种

6.2畜牧业生产及医学

6.3保护家畜遗传资源

第二部分实验研究

前言

1.材料

1.1实验动物

1.2药品及试剂

1.3主要仪器设备

2.实验方法

2.1溶液的配制

2.2超排及采卵

2.3胚胎的玻璃化冷冻

2.4胚胎的解冻及保护剂脱除

2.5胚胎体外培养

2.6胚胎移植

3.数据处理

4.结果

4.1一步法和二步法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚和囊胚体外发育

4.2一步法和两步法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚和囊胚的体内发育

4.3玻璃化液处理小鼠桑椹胚和囊胚(未冷冻)体外发育

4.4细管法和OPS法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚和囊胚的体外发育

4.5 OPS法玻璃化冷冻小鼠桑椹胚和囊胚的体内发育

5.讨论

5.1平衡方法对胚胎玻璃化冷冻效果的影响

5.2玻璃化抗冻保护剂的毒性

5.3种间差异、胚胎发育阶段及胚胎来源

5.4冷冻载体对胚胎玻璃化冷冻效果的影响

6.结论

参考文献

致谢

附图及说明

攻读学位期间发表的学术论文