沉默的小麦1By高分子量谷蛋白亚基的分子克隆

摘要

高分子谷蛋白亚基(High-molecular-weight subunits)是普通小麦(Triticum aestivum L．，AABBDD,2n=6x=42)胚乳中的重要贮藏蛋白。高分子谷蛋白亚基的组成和含量影响小麦的加工品质。理论上讲，在SDS-PAGE电泳图谱上，普通小麦应该有6条高分子谷蛋白亚基，但是由于部分基因处于沉默或不表达状态，大多数小麦品种只有3～5条带。在普通小麦中编码亚基1Bx,1Dx,1Dy的基因通常被表达，编码亚基1Ax，1By的基因在某些品种中不表达，而亚基1Ay通常不表达。在以前的研究中，小麦1Ay和1Ax的沉默机制已有报道。已报道的HMW-GS基因沉默方式有两种：转座子插入导致的编码失活；无义突变导致编码序列出现提前终止密码子。目前，还没有关于小麦1By基因沉默机制的报道。本研究通过对未表达的1By基因的编码序列进行克隆、测序分析，旨在揭示其沉默的分子机制，结果如下： 1．普通小麦沉默的高分子量谷蛋白亚基1By的分离与鉴定用特异引物对未表达1By亚基的云南铁壳麦(AS332)和西藏半野生小麦(AS908)基因组总DNA进行PCR扩增，分别获得一条大小介于1.9到2.0kb的目的条带。扩增产物分别克隆到pMD18-T载体中，经梯度亚克隆测序拼接，得到材料AS332和AS908编码区的全序列，都为1979bp。序列提交到GenBank，序列号分别为EF381741(AS332)， EF381742(AS908)。经NCBI上的相关软件比对，发现它们和小麦品种xingkehan的1By9(AY486485)亚基的DNA序列同源性最高，由此判断沉默的亚基是1By9亚基。 2．普通小麦沉默的高分子量谷蛋白亚基1By9的序列特征Xingkehan表达的1By9基因的DNA序列全长为1980 bp，材料AS332和AS908沉默的1By9基因的DNA序列与其相比，缺失一个碱基，两材料缺失的碱基都为A，只是缺失的位置不同，AS332缺失的A位于编码起始位置下游995 bp处，而AS908缺失的A位于编码起始位置下游785 bp处。根据以前研究的1By9(AY486485)的DNA序列翻译成氨基酸序列，其一级结构包括一个信号肽(21个氨基酸残基)，一个N-末端(104个氨基酸残基)，一个C-末端(42个氨基酸残基)和一个中心重复区(491个氨基酸残基)。在本研究的两个材料中，如果都忽略缺失的碱基A，得到假定的氨基酸序列也包括信号肽，N-末端，C-末端和中心重复区，与Xingkehan表达的IBy9亚基高度相似。但由于DNA序列中缺失了碱基A，导致DNA序列翻译的阅读框在缺失处发生了改变，产生了移码突变，从而改变了氨基酸的序列。其中材料AS332从第320个氨基酸处被改变，材料AS908从第262个氨基酸处被改变。同时由于移码突变的产生使云南铁壳麦AS332出现了5个提前终止密码子，分别位于1160bp(TAG)，1178bp(TAG)，1544bp(TAG)，1670bp(TAG)，1688bp(TAG)处，除了以上5个提前终止密码子之外，西藏半野生小麦还在780 bp(TAG)处出现了一个额外的提前终止密码子。 3．普通小麦高分子量谷蛋白亚基1By9基因沉默的分子机制虽然材料AS332和AS908在分类上不同，AS332属于Taestivum ssp．yunnanese King，AS908属于R.aestivum ssp．tibetanum Shao，但是它们的沉默方式都是由于删除核苷酸出现移码突变导致出现多个提前终止密码子TAG，而且删除的核苷酸A都发生在三联体密码CAA处，即CAA变成CA。三联体密码CAA编码甘氨酸(Gin)。以前报道的HMW-GS基因沉默的方式包括以下两类：一是，转座子插入导致的编码失活；二是，编码区由于C→T的单核苷酸替换直接导致出现提前终止密码子(CAA—TAA)。但本研究却发现与之不同的沉默方式，即由于编码苷氨酸(Gin)的三联体密码CAA删除了一个A，发生了移码突变，改变了翻译读框，致使在编码区的下游出现了多个提前终止密码子，氨基酸序列的翻译被提前终止。这是小麦HMW-GS基因沉默的一种新的分子机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1 小麦储藏蛋白的组成及分类

1.2小麦高分子量谷蛋白

1.3小麦HMW-GS基因沉默的研究现状

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

2.2.1 SDS-PAGE分析

2.2.2基因组DNA提取

2.2.3基因组DNA的PCR扩增，回收

2.2.4 PCR产物T-载体克隆

2.2.5热击感受态的制备

2.2.6转化大肠杆菌

2.2.7阳性克隆的筛选

2.2.8提取质粒

2.2.9定向缺失制备亚克隆

2.2.10 DNA序列测定与分析

3结果与分析

3.1 SDS-PAGE分析

3.2基因分离与序列测定

3.3核酸及推导的氨基酸序列分析

4讨论

参考文献

致谢

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