野生二粒小麦1Ay高分子量谷蛋白亚基的分子克隆及其“表达—沉默”机理探讨

摘要

野生二粒小麦(Triticumdicoccoides，2n=4x=28，AABB)是普通小麦(T.aestivumL.，2n=6x=42，AABBDD)A、B染色体组的供体祖先种，是进行普通小麦改良的重要遗传资源。已有研究表明，野生二粒小麦具有丰富的HWM-GS变异类型，且存在普通小麦中根本不表达的1Ay亚基。本研究通过基因克隆与染色体工程相结合的方法，对野生二粒小麦中的1Ay基因进行了分子克隆及其结构研究，以探讨1Ay基因的“表达-沉默”机制，获得主要结果如下： 1.野生二粒小麦高分子量谷蛋白1Ay亚基的分离与鉴定野生二粒小麦D1和D100的HMW-GS在SDS-PAGE中分离结果表明，两份供试材料均为明显表达三条带，另有一条相对其他三条带显得弱的带，怀疑其为表达的1Ay亚基。为检测上述疑为1Ay亚基条带的真实与否，本研究进一步进行了分子克隆。用简并引物对野生二粒小麦D1和D100基因组总DNA进行PCR扩增，分别获得一条大小介于1.8到2.0kb的目的条带。经克隆测序，得到D1和D100编码区的全序列，分别为1812bp和1830bp。经同源性比较分析发现二者与已报道的栽培二粒小麦的1Ay基因(AY260548)的DNA序列同源性最高。 2.野生二粒小麦高分子量谷蛋白1Ay亚基的分子序列特征供试材料D1的1Ay基因的核酸序列与乌拉尔图小麦(T.urartu，2n=2x=14，AA)的活性态1Ay基因(AY245578)的DNA序列(全长1830bp)相比，出现了1个提前终止密码子，位于208bp(TGA)处。材料D100的1Ay基因则出现了3个提前终止密码子，分别位于451bp(TAA)，856bp(TAA)，1353bp(TAG)。根据乌拉尔图小麦活性态1Ay基因AY245578氨基酸序列的一级结构包括一个信号肽(21个氨基酸残基)，一个N-末端(104个氨基酸残基)，一个C-末端(42个氨基酸残基)和一个中心重复区(441个氨基酸残基)的结果，对本研究的供试材料D1和D100进行类推，如果忽略其提前终止密码子，得到假定的氨基酸序列也包括信号肽，N-末端，C-末端和中心重复区。但是，D1的核酸序列较AY245578少了18bp(CCAGGACAAGGGCAACAA)，位于805～823bp处，致使其氨基酸序列在中心重复区缺失了一个六肽(PGQGQQ)。而材料D100的核酸和氨基酸序列长度则与之相同。 3.高分子量谷蛋白亚基1Ay基因沉默的分子基础首次发现在供试材料D1的整个编码区内仅在N-末端出现唯一的提前终止密码子，而以往报道的提前终止密码子均出现在中心重复区。通过供试材料D100的1Ay基因序列分析，发现编码区451bp处出现了少见的由腺嘌呤向胸腺嘧啶突变(即A→T)使三联体密码AAA突变成终止密码子TAA的现象，这无疑显示出野生二粒小麦1Ay基因沉默机制的特异性。同时，通过对野生二粒小麦与普通小麦杂交后代1Ay基因的分子克隆和序列分析，首次发现染色体工程过程会导致子代中产生新的终止密码子，而且其位置具有相对稳定性。据此推测，被认为在普通小麦中永不表达的1Ay基因很可能是由于一粒系小麦在进化为异源六倍体普通小麦(AABBDD)的过程中，出现了新的提前终止密码子所致。 4.小麦高分子量谷蛋白亚基性状遗传的分子证据本研究通过对野生二粒小麦与普通小麦远缘杂交(D1×川农16)F4代及其F5代1Ay基因的分子克隆和序列分析发现，F4和F5代之间的DNA序列同源性高达99.58％，而且其上下两代的提前终止密码子在数目和位置上均保持完全一致。这无疑为高分子量谷蛋白亚基是稳定遗传的质量性状提供了分子佐证。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1小麦储藏蛋白的组成及分类

1.2小麦高分子量谷蛋白

1.3小麦HMW-GS1Ay基因沉默的研究现状

1.4野生二粒小麦研究进展

1.5本研究的目的

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

2.2.1 SDS-PAGE分析

2.2.2根尖细胞有丝分裂染色体观察

2.2.3基因组DNA提取

2.2.4基因组DNA的PCR扩增，回收

2.2.5 PCR产物T-载体克隆

2.2.6热击感受态的制备

2.2.7转化大肠杆菌

2.2.8阳性克隆筛选

2.2.9 DNA序列测定与分析

3结果与分析

3.1 SDS-PAGE分析

3.2 F4代籽粒的根尖细胞有丝分裂观察

3.3 1Ay基因的分离与序列测定

3.4核酸及推导的氨基酸序列分析

4讨论

4.1野生二粒小麦1Ay基因的“表达-沉默”性

4.2小麦高分子量谷蛋白基因提前终止密码子形成的变异性

4.3小麦属1Ay基因“表达-沉默”与染色体工程过程的可能关系

参考文献

致谢