pDNAIL-1β、pDNAIL-16真核表达质粒构建及对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应研究

摘要

采用PCR从含有鸡白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)与白细胞介素16(interleukin-16，IL-16)基因的PMD18-T质粒PCIL-1β、PCIL-16中获取鸡IL-1β与IL-16基因，分别用BamH I和EcoR I、BamH I和EcoR V双酶切后与同样酶切过的真核表达质粒pcDNA3.1连接，并进行序列测定，pDNAIL-1β中IL-1β基因全长开放阅读框为804bp，pDNAIL-16中IL-16基因全长开放阅读框为1824bp，与PCIL-1β、PcIL-16中IL-1β与IL-16序列完全一致，成功构建了pDNAIL-1β及pDNAIL-16真核表达质粒。 将两种质粒用阳离子脂质体包裹，分别或共同与禽流感疫苗联合免疫，观察IL-1β、IL-16分子佐剂对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应。将1日龄非免疫健康雏鸡100只，分成5组：重组H5亚型禽流感病毒灭活疫苗AI(A)、AI-pcDNA3.1(B)、AI-pDNAIL-1β(C)、AI-pDNAIL-16(D)、AI-pDNAIL-1β+pDNAIL-16(E)。 采用微量血凝抑制试验法(HI)，分别在免疫后7d、14d、21d、28d、35d检测禽流感特异性抗体，比较各组试验鸡的抗体水平。实验结果表明：与对照组相比，IL-1β组抗体水平显著提高(P<0.05)，使抗体滴度较对照组提高了21g2以上，且在免疫后35d仍保持在接近峰值的水平。IL-16组抗体水平在实验前期迅速提高(P<0.05)，但在实验中后期的HI抗体水平与对照组无显著差异(P>0.05)。IL-1β+IL-16组HI抗体水平在免疫后迅速升高，并在免疫后14d显著高于IL-1β组与IL-16组(P<0.05)，直到35d未见下降趋势。表明鸡IL-1β、IL-16分子佐剂可使禽流感疫苗免疫后HI抗体提前(免疫后7d)达到完全保护水平(≥51g2)，且明显延长抗体峰值的持续时间。 用流式细胞仪对CD4+、CD8+及CD3+T细胞亚群进行了监测，实验结果表明：3个免疫佐剂组免疫后外周血中CD4+与CD3+T细胞的百分含量显著提高(P<0.05)，IL-1β、IL-16组在实验后期CD4+T细胞百分含量高于IL-1β组和IL-16组，但差异不显著(P>O.05)：CD3+T细胞亚群的变化与IL-1β组和IL-16组相近。分子佐剂组的CD8+T细胞水平与对照组无显著差异。表明鸡IL-1β、IL-16分子佐剂能显著提高机体CD4+、CD3+T细胞百分含量。 本研究结果表明，表明鸡IL-1β、IL-16分子佐剂可使禽流感疫苗免疫后HI抗体提前(免疫后7d)达到完全保护水平(≥5lg2)，延长抗体峰值的持续时间，且显著提高CD4+、CD3+T细胞百分含量(P<0.05)。鸡IL-1β、IL-16分子佐剂对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应的研究国内未见报道，本研究为增强禽流感灭活疫苗的免疫应答水平的研究提供了一些参考。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1禽流感的流行现状

1.2禽流感疫苗及疫苗免疫中存在的问题

1.3细胞因子免疫佐剂进展

1.4白细胞介素1β研究进展

1.5白细胞介素16研究进展

1.6本研究的前期工作基础

1.7本研究目的意义

2.实验材料

2.1质粒与菌株

2.2实验动物和疫苗

2.3主要试剂

2.4主要培养基

2.5其它实验材料

2.6主要仪器设备

3.方法

3.1 CHIL-1β和CHIL-16基因的获取

3.1.1引物设计

3.1.2鸡IL-1β、IL-16基因PCR扩增

3.1.3 PCR产物的回收

3.2重组质粒PDNAIL-1β和PDNAIL-16的构建及鉴定

3.2.1载体pcDNA3.1的制备

3.2.2chIL-1β、chIL-16片段和pcDNA3.1片段的连接

3.2.3连接产物的转化

3.2.4 pDNAIL-1β、pDNAIL-16重组真核表达质粒的筛选及鉴定

3.3质粒PDNAIL-1β、PDNAIL-16的大量制备

3.3.1宿主菌的培养

3.3.2质粒的大量提取及纯化

3.4质粒PDNAIL-1β、PDNAIL-16脂质体复合物制备

3.5实验动物的分组及免疫

3.6分子免疫佐剂PDNAIL-1β和PDNA-IL16对禽流感疫苗的佐剂效应检测

3.6.1禽流感HI抗体水平的测定

3.6.2 CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞亚群数量测定

4.结果

4.1CHIL-1β和CHIL-16基因的获取

4.2重组质粒PDNAIL-1β、PDNAIL-16的鉴定

4.2.1菌落PCR

4.2.2质粒双酶切鉴定

4.2.3 chIL-1 β和chIL-16基因的序列测定

4.3质粒PDNAIL-1β及PDNAIL-16的大量制备

4.4 PDNAIL-1β及PDNAIL-16真核表达质粒分子佐剂的制备结果

4.5分子免疫佐剂PDNAIL-1β和PDNAIL-16对禽流感疫苗的佐剂效应测定结果

4.5.1禽流感HI抗体水平测定结果

4.5.2 AI-pDNAIL1β、AI-pDNAIL16免疫后CD4+、CD8+及CD3+T淋巴细胞亚群数量测定

5.分析与讨论

5.1 PDNAIL-1β、PDNAIL-16分子佐剂目的基因的选择

5.2真核表达载体的选择

5.3 PDNAIL-1β、PDNAIL-16单独和联合使用对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应

5.3.1 pDNAIL-1β对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应

5.3.2 pDNAIL-16对H5亚型禽流感灭活疫苗的佐剂效应

5.3.3 pDNAIL-1β及pDNAIL-16的联合使用对H5亚型禽流感疫苗的免疫佐剂效应

6.结论

参考文献

致 谢

附录

在读期间发表的论文