玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2Cα的克隆及其在干旱胁迫下的表达特性

摘要

干旱是玉米生产中最重要的非生物胁迫之一。据估计，在热带雨林地区每年因干旱造成的损失约17％，在非洲南部高达60％，在亚洲约37％左右。我国有60％的玉米面积受到干旱胁迫，每年因旱灾而减产15％-20％，仅次于病虫害的危害。研究表明，玉米不同自交系在耐旱性上存在显著差异。但是，耐旱性是众多形态、生理和生化特性协同作用的结果，而且不同的基因型可能涉及不同的胁迫应答方式，加之环境因素的干扰，耐旱性的鉴定在通常条件下比较困难。因此，耐旱候选基因的鉴定将有助于提高耐旱分子标记辅助选择育种的效率。同时，对于改良玉米品种的耐旱性有重要的指导意义。 在前期研究中，本实验室结合干旱地区品种推广实践，在严格控制土壤水分的干旱条件下，从57个常用玉米自交系中筛选出3个耐旱自交系“81565”、“N87-1”、“R09”和2个不耐旱自交系“200B”、“ES40”。并利用改进的DDRT-PCR技术分析玉米强耐旱自交系81565在干旱处理和正常浇水对照差异表达的基因，发现MDl、MD2和MD3三个在干旱胁迫下差异表达的基因片段，其中MD2为下调表达。序列分析和同源性比较表明，MD2与极端耐旱的鼠尾栗属Sporobolus stapfianus丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因有88％相似性。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术相结合的方法克隆了MD2基因片段的cDNA全序列，并通过序列比对和保守结构域预测确定了该基因所编码蛋白的种类。采 SYBR Green I的real-time PCR技术检测干旱胁迫下该基因的mRNA在不同耐旱玉米自交系中的表达特性及该基因在玉米不同组织中的表达特性。主要结果如下： 1．以mRNA差异显示片段MD2的eDNA序列为信息探针，对玉米EST数据库进行同源检索，通过DNASTAR软件的Seqman程序对同源性序列进行拼接组装，最后得到一条长度为1731 bp的Contig。为了验证电子克隆序列的正确性，采用RT-PCR技术对电子拼接序列进行克隆、序列分析验证，并采用生物信息学的方法确定了该基因所编码蛋白的种类。RT-PCR扩增克隆到该Contig两个开放阅读框(ORF)片段，长度相差213bp。序列分析表明，长片段QH1与电子克隆的序列完全一致，短片段QH2是QH1片段缺失T213 bp形成的，推测这两个片段是该基因内含子选择性剪接的产物。ORF分析结果发现，QHl包含一个长度为1 167 bp的ORF，编码388个氨基酸的多肽；QH2含有一个长度为954 bp的ORF，编码317个氨基酸的多肽。同源性分析表明，QHl和QH2推测的氨基酸序列与老鼠、人、酵母的PP2C基因的一致性为34％，与拟南芥两个PP2C基因AB11和AB12的一致性为35％。SMART程序分析表明，QH1和QH2所编码的蛋白均具有典型的PP2C蛋白的催化结构域，而且该催化区域内与二价金属离子结合的MED，DGH，DG和D残基和与磷酸盐离子结合的R残基都是保守的。因此，推断我们所克隆的QHl和QH2基因编码的蛋白均属于PP2C型。序列比对表明，QHl和QH2与目前已报道的2个玉米PP2C基因ZmPP(AF213455)和ZmPP2C(AY621066)]在核苷酸的组成上没有明显的相似性，因此，我们确定从玉米叶片中分离到的基因为PP2C基因家族中新成员，命名为ZmPP2Ca，并将其序列提交给GenBank数据库，登录号为EFl95257。 2．采用RT-PCR分析了ZmPP2Ca基因QHl和QH2转录本的表达情况。结果表明，在正常浇水对照叶片组织中，两个转录本均有表达，但QHl表达量比QH2高，说明ZmPP2Ca基因的选择性剪接不是干旱处理的结果，是在胁迫之前就已经存在的。在干旱胁迫下，两个转录本中主要是QH1参与玉米干旱胁迫的响应。 3．以3个耐旱自交系“81565”、“N87-1”、“R09”和2个不耐早自交系“200B”、“ES40”为材料，采用室内盆栽，正常条件下生长至9叶期。在土壤含水量略高于萎蔫系数的干旱强度下(土壤绝对含水量为10％-12％)，用16％聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱处理(-0．5Mpa)，3h、6h、12h、24h和48h后，取相同叶位的叶片用Trizol试剂提取总RNA，正常浇水为对照。用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术分析干旱胁迫下ZmPP2Ca基因在不同耐旱自交系中的表达特性。在干旱胁迫下，ZmPP2Ca基因在3个耐旱自交系“81565”、“R09”和“N87-1”中的表达量呈现下调表达的模式，在胁迫处理6 h时，表达量降到最低水平。在2个不耐旱自交系“200B””和“ES40”中的表达量呈现上调表达的模式。参考催化其逆反应的蛋白磷酸激酶在植物耐旱性中的重要作用，可以认为玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2Ca，与玉米对干旱胁迫的应答有关。 4．提取玉米自交系“81565”的根、茎、叶和叶鞘的总RNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR．技术检测ZmPP2Ca基因在不同玉米组织中的表达模式。结果表明，ZmPP2Ca基因在玉米的根、茎、叶、叶鞘中均有表达，但不同器官间表达量差异明显，其顺序为叶>叶鞘>茎>根。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词及中英文对照

声明

第一章文献综述

1植物水分胁迫信号转导

1.1水分胁迫诱导表达的基因

1.2水分胁迫应答基因的表达调控

1.3水分胁迫信号识别与转导

1.4玉米水分胁迫应答基因的研究现状

2高等植物的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C

2.1蛋白可逆磷酸化在生物信号传递中的作用

2.2蛋白磷酸酶的分类

2.3 PP2C的理化性质

2.4 PP2C基因及其蛋白质结构特征

2.5 PP2C在高等植物中的功能与作用

3转录水平上基因定量(mRNA丰度)分析的常规方

3.1 Northern印迹(Northern Blotting Hybridization)

3.2基因芯片技术

3.3核糖核酸酶保护试验(ribonuclease protection assay,RPA)

3.4实时荧光定量PCR

4获取基因全长cDNA的方法及其进展

4.1 cDNA文库筛选法

4.2 cDNA末端快速扩增法

4.3电子克隆(In silico cloning)

4.4获取全长cDNA的其它方法

5本研究的目标

第二章玉米ZmPP2Ca基因全长cDNA的序列克隆

引言

1材料

1.1植物材料

1.2载体与菌株

1.3网络资源及应用软件

1.4主要药品和试剂

1.5主要仪器

1.6所用溶液以及配制

2实验方法

2.1 MD2片段的cDNA全序列的克隆

2.2测序及序列生物信息学分析

3结果与分析

3.1玉米PP2C新基因的克隆

3.2测序及序列生物信息学分析

4 讨论

4.1玉米ZmPP2Ca基因的电子延伸

4.2引物设计

4.3克隆测序

4.4 ZmPP2Ca基因的选择性剪接

4.5 ZmPP2Ca基因可能参与的信号转导通路

5小结

第三章玉米ZmPP2Ca基因的表达特性

引言

1材料

1.1植物材料

1.2载体与菌株

1.3主要试剂和试剂盒

1.4主要仪器与耗材

1.5所用溶液及其配制

2实验方法

2.1 ZmPP2Ca基因在干旱胁迫下的表达特性

2.2 ZmPP2Ca基因在不同玉米组织中的表达特性

3结果与分析

3.1总RNA的浓度和纯度鉴定

3.2 ZmPP2Ca基因在干旱胁迫下的表达模式

3.3 ZmPP2Ca基因的组织表达特性

4讨论

4.1材料的干旱处理及其对玉米锈病的抗性

4.2 RNA的制备与检测

4.3使用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行real-time PCR的条件优化

4.4内参基因的选择

4.5定量PCR实验中应该注意的几个问题

4.6 ZmPP2Ca基因在干旱胁迫下的表达模式

4.7 ZmPP2Ca基因的组织表达特性

5小结

第四章本文今后的研究方向

参考文献

致谢

附录