鱼源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的纯化与致病性研究

摘要

本试验从嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物中提纯到一种胞外蛋白酶(ECPase)，并对提纯的ECPase进行了致病性研究，以期搞清胞外蛋白酶是否是致病因子，其在致病中是否起重要作用，并为养殖生产中防治该病提供理论依据。 在胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基基础上，对体外培养嗜麦芽寡养单胞菌的胞外蛋白酶(ECPase)产生条件进行了优化。结果发现，其产量与碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基初始pH值有关。其优化产酶条件为：以蔗糖作为碳源，胰蛋白胨作为氮源，培养基初始pH值为 7.0，在20℃下120r/min振荡培养72h，嗜麦芽寡养单胞菌可产生大量的 ECPase。 在优化培养条件下，采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50离子交换层析、SDG-PAGE等方法对嗜麦芽寡养单胞菌的胞外蛋白酶进行了分离纯化。结果表明嗜麦芽寡养单胞菌产生一种单一多肽，分子量为45.7Kda的胞外蛋白酶。 将倍比稀释的胞外蛋白酶与96孔板培养的Vero细胞一起培养，发现Vero细胞变性坏死，脱落，出现空斑；将ECPase腹腔注射小白鼠和斑点叉尾鲴，表现出很高的死亡率。其对小白鼠和斑点叉尾鮰的LD<,50>分别为4.33ug/g和3.49ug/g体重。接种小白鼠精神倦怠，排黏液便，剖解发现严重胃肠炎症状，肠道扩张，脾严重肿大、出血；光镜下可见肠粘膜上皮细胞坏死脱落，心肌细胞肿胀，严重颗粒变性，脾脏出血，大量红细胞浸润。死亡斑点叉尾鮰鳃丝肿胀，出现轻微肠炎，肝、脾、肾肿大等病变；肝细胞和肾小管上皮细胞变性坏死，脾出血，肝、脾、肾是ECPase作用的靶器官；超微病变也很明显，主要表现为多数组织器官的细胞核膜扩张，核染色质溶解消失，线粒体肿胀。虽未见临床上广泛出现的肠套叠现象，但肝、脾、肾的病变均与该菌自然感染发病的病变相似，表明嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶是一种重要的致病因子。

目录

声明

摘要

文献综述

研究目的和意义

1试验材料

2试验方法

2.1细菌的复苏和培养

2.2细菌产胞外蛋白酶的培养条件筛选

2.2.1不同碳源对细菌产酶的影响

2.2.2不同氮源对细菌产酶的影响

2.2.3培养时间对产酶的影响

2.2.4培养温度对产酶的影响

2.2.5培养基初始pH值对产酶的影响

2.2.6胞蛋白酶活性的测定——底物法

2.3嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的提纯

2.3.1细菌胞外产物的提取

2.3.2胞外蛋白酶的分离纯化

2.4蛋白酶致病性研究

2.4.1蛋白酶对Vero细胞毒性研究

2.4.2蛋白酶对小鼠致病性

2.4.3蛋白酶对斑点叉尾鮰的致病性

3结果

3.1嗜麦芽寡养单胞菌产胞外蛋白酶的优化培养条件

3.2嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的分离纯化结果

3.3致病性研究结果

4分析与讨论

5结论

参考文献

附图

攻读硕士期间发表的学术文章情况

致谢