猪卵母细胞孤雌激活、体外受精及冷冻保存技术研究

摘要

猪是一种在转基因生物反应器领域有着广阔应用前景的理想动物模型，需要建立一套有效的体外繁殖技术为转基因猪生产提供大量高质量的成熟卵母细胞和胚胎。本研究以建立猪细胞克隆前期激活体系和体外胚胎生产为目的，系统的研究了卵母细胞成熟体系、体外孤雌激活体系、体外受精体系和冷冻方法。 结果表明：每月的各级卵巢百分比走势：一级卵巢比例随着天气的变热逐渐减少，到六、七月达到低谷；二级卵巢比例相对受气候变化影响较低整体上走势都比较平稳；三级卵巢比例则走势正好与一级相反；每个卵巢采卵平均数在六月至九月处于低水平，在气候凉爽的四、五、九、十月的卵巢质量和检卵平均数比较高。卵母细胞后半程成熟培养体系中有无激素对卵母细胞的成熟率影响差异不显著(P<0.01)；卵母细胞成熟培养时，细胞浓度为100个/400μl的成熟率最佳；不同成熟体系的成熟培养效果以NCSU-23+10％FBS为最佳；而卵母细胞激活后发育培养体系以NCSU-23+BSA卵母细胞发育的培养效果更好。 用CRY-3细胞激活仪进行电激活时，脉冲电压应小于等于200V，脉冲时程可为20μs、40μs、80μs，脉冲次数应低于3次，其中以120v/20μs/1次，150v/20μs/2次两组的激活效果最佳。电激活(150v/20μs/2次)与几种化学激活(5μg/mlCB；CB+2mM/L6-DMAP；CB+150μM/Lγ-BLI)联合使用时，以电+CB+γ-BLI联合激活效果最好；比较γ-BLI几个浓度梯度的激活效果发现，以γ-BLI浓度为600μM组的激活效果最为理想。 冷冻精液IVF，多精入卵率随着共孵时间或精子浓度的增长而增加，精卵共孵6h的受精效果最为理想。以解冻后活力为0.1左右的冷冻精液进行体外受精时，精子浓度以10<'7>为宜。两种不同卵母细胞成熟培养基与受精前两种不同卵母细胞去除卵丘处理方法联合作用表明，部分去除卵丘组优于完全去净组，其中以NCSU-23+FBS+部分去除卵丘组的IVF后发育效果最佳。鲜精的体外受精效果，优于冷冻后的精液，但除8-细胞率(78.01±1.53％vs68.09±1.08％)外，各项指标差异都不显著(P>0.05)。 用三种冷冻方法(OPS法；自制移液枪头法；移液枪头法+离心法)对MⅡ卵母细胞冷冻的结果表明，自制移液枪头法优于OPS法，其中以移液枪头法+离心组的冷冻效果最好；用移液枪头法对体外发育到 8-细胞期卵母细胞的冷冻效果不理想。MⅡ期卵母细胞用 OPS 法冷冻后卵母细胞IVF和电激活的卵裂率都显著高于移液枪头法(P<0.01)，电激活后2-细胞卵裂率比IVF高。 本试验推荐猪体外成熟培养体系为连续培养液48h的NCSU-23+10％FBS，细胞浓度为100个/400μl，发育培养体系为NCSU-23+BSA；用CRY-3细胞激活仪电激活时(电融槽宽度为1mm)为150v/20μs/2次+600μMγ-BLI；以活力为0.1左右的冷冻精液进行IVF时，精子浓度为10<'7>，共孵时间为6h，并在成熟处理时只部分去除卵丘细胞；MⅡ卵母细胞冷冻时，方法为移液枪头法+离心法，冷冻后激活的 2-细胞卵裂率比IVF高。季节对卵母细胞质量和采卵平均数影响显著(P<0.05)。

目录

文摘

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论文说明：简写及缩语

声明

前言

第一部分文献综述

1.猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活(PA)和胚胎的体外生产(IVP)

1.1影响卵母细胞的体外成熟(IVM)的因素

1.2孤雌激活(PA)方法研究

1.3胚胎的体外生产(in vitro production,IVP)

2.猪冷冻精液体外受精的研究进展

2.1猪精液冷冻保存技术研究进展

2.2猪体外受精的研究进展

3.超低温玻璃化冷冻在猪方面的研究进展

3.1冷冻保护剂的选择

3.2方法学研究

3.3冷冻前的处理

3.4去脂

3.5玻璃化冷冻对猪卵母细胞或胚胎的损伤

3.6解冻后胚胎质量的评价

第二部分实验研究

1.实验目的意义

1.1目的

1.2意义

2.材料和方法

2.1试验材料

2.2实验方法

2.3实验设计

2.4统计与分析

3.实验结果

3.1体外成熟体系的比较

3.2月份对卵巢质量和检卵平均数的影响

3.3卵母细胞激活参数的优化

3.4电激活与几种化学激活联合使用的比较

3.5最佳γ-丁内脂(γ-BLI)激活浓度的确定

3.6不同共孵时间的受精能力的比较

3.7不同精液稀释浓度后受精能力的比较

3.8不同卵母细胞成熟培养基和受精后不同清洗处理方法对胚胎发育的影响

3.9冻精和鲜精受精能力的比较

3.10 MⅡ期卵母细胞不同冷冻方法的比较

3.11 8-细胞期卵母细胞冷冻研究

3.12 MⅡ期卵母细胞冷冻后受精和电激活能力比较

4.讨论

4.1体外成熟体系的比较

4.2月份对卵巢质量和检卵平均数的影响

4.3卵母细胞激活参数的优化

4.4电激活与几种化学激活联合使用的比较

4.5最佳γ-丁内脂(γ-BLI)激活浓度的确定

4.6不同共孵时间的受精能力的比较

4.7不同精液稀释浓度后受精能力的比较

4.8不同卵母细胞成熟培养基和受精后不同清洗处理方法对胚胎发育的影响

4.9冻精和鲜精受精能力的比较

4.10 MⅡ期卵母细胞不同冷冻方法的比较

4.11 8-细胞期卵母细胞冷冻研究

4.12 MⅡ期卵母细胞冷冻后受精和电激活能力比较(自制枪头法+离心)

5结论

参考文献

致谢

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