利用农杆菌介导法将抗稻瘟病基因Pi-d2导入杂交稻骨干亲本蜀恢527的研究

摘要

水稻是最重要的粮食作物之一，全世界有近半数的人口以稻米为主食。稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthegrisea，无性世代为Pyriculariagrisea)引起的广泛发生于世界各水稻产区的主要真菌病害，由于病原菌致病性的高度分化，使得对稻瘟病很难有效控制。长期的实践证明，培育和利用抗病品种是稻瘟病有效防治最有用的办法。随着基因工程的发展，利用转基因技术导入外源基因改良稻瘟病抗性已成为一条新途径，利用该技术可向现有栽培品种中导入外源抗病基因而不受种属限制，拓展了可利用基因的来源。籼稻是栽培水稻的主要品种类型，与粳稻相比，大量籼稻品种具有较差的组培特性和低转化效率，这种现状严重限制了转基因技术在籼稻育种上的应用。抗稻瘟病基因Pi-d2在水稻根、茎、叶中均为组成型表达，编码的蛋白其氨基末端含有一个17个氨基酸的胞外结构域信号肽和信号识别区，羧基末端为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区，中间为一个疏水的跨膜结构，可能是一类新的抗病基因。本研究首次利用农杆菌介导法将.Pi-d2基因转入籼稻品种蜀恢527和粳稻品种中花11中，进行了分子生物学检测、GUS活性检测和抗病性鉴定，建立了适合于蜀恢527的高效植株再生体系，初步得到了对稻瘟病抗性提高的水稻材料，为水稻及其它禾本科植物抗病分子育种奠定了基础。主要研究结果如下： 1.不同受体材料、不同外植体的愈伤组织诱导率不同，蜀恢527、蜀恢498、中花11和台北309四个品种的幼胚愈伤组织诱导率最高分别为88.7％、87.5％、91.4％和96.0％，成熟胚愈伤组织诱导率最高分别为78.5％、75.3％、85.1％和86.3％。对四个水稻材料而言，总体表现为幼胚出愈率高于成熟胚，粳稻出愈率高于籼稻。 2.建立了适合籼稻品种蜀恢527遗传转化的高效植株再生体系。实验结果表明，在基本培养基NMB中添加2.0mg/L2,4-D有利于蜀恢527愈伤组织的诱导和继代培养；MS+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LKT+0.25mg/LNAA的分化培养基有利于愈伤组织的分化；继代两次的愈伤组织分化率最高，部分干燥处理分化前的愈伤组织有利于分化。 3.抗性愈伤率和出苗率是影响转基因效率的主要因素，尤以后者的影响最大。在实验中发现，蜀恢498经过潮霉素筛选后虽然能得到大量的抗性愈伤组织，但是分化成苗很困难。 4.转Pi-d2基因水稻植株的获得。以不同水稻品种的幼胚和成熟胚作为外植体，通过农杆菌介导法将目的基因的三种不同表达载体(pCB6.3kb、pCB5.3kb、pZH01-2.72kb)导入水稻中，最终共得到292株再生植株，对其进行目的基因的PCR检测，有176株显示为阳性，其中蜀恢527有87株，蜀恢498有1株，中花11有37株，台北30％有51株。对Pi-d2基因进行了RT-PCR分析，结果表明Pi-d2基因在转录水平上得到了表达。 5.对转基因植株T1代的潮霉素抗性分析表明，蜀恢527和台北309分别有64.6％和68.2％的株系表现3:1的分离，符合孟德尔单基因遗传规律，表明外源基因多数是以单位点形式整合。 6.转基因植株稻瘟病抗性提高。对25个独立转基因株系的T1代植株接种结果表明，转基因植株对稻瘟病生理小种ZB15的抗性提高，病斑大小和数量减少，抗性呈孟德尔和非孟德尔分离。目的基因三种表达载体在受体中所表现的对ZB15的抗性无明显差异。 7.转基因植株农艺性状无显著可遗传变异。对转基因水稻当代及T1代的重要农艺性状考查结果表明，转基因的插入和组培过程可能导致受体的一些农艺性状的变异，但绝大多数是不可遗传的，在后代中能够恢复。

目录

文摘

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论文说明：缩写词(Abbreviation)

声明

Ⅰ文献综述

1.水稻稻瘟病的研究概况及水稻对稻瘟病抗性的研究

1.1稻瘟病菌的生物学基本特征

1.2稻瘟病菌侵染宿主的基本过程

1.3稻瘟病生理小种研究

1.4稻瘟病致病的分子机制

1.5水稻对稻瘟病抗性的研究

2.水稻抗稻瘟病育种研究

2.1常规抗病育种

2.2生物技术育种

3.基因工程在作物育种中的应用

3.1抗病性基因工程

3.2改良品质

3.3抗虫性基因工程

3.4抗除草剂基因工程

3.5抗逆性基因工程

3.6创造新的不育系、保持系和恢复系

3.7植物生物反应器研究

3.8进一步提高水稻产量

4.水稻转基因的主要方法及原理

4.1农杆菌介导法

4.2基因枪转化法

5.籼稻基因工程抗病育种所面临的问题及对策

5.1籼稻基因工程面临的主要问题和对策

5.2对水稻抗病机制了解不够

6.本研究的目的和意义

Ⅱ 材料与方法

1.材料

1.1植物材料

1.2菌株和质粒

1.3培养基成分

1.4重要试剂及溶液

1.5重要仪器设备

2.试验方法

2.1不同外植体诱导愈伤和继代

2.2植株再生

2.3愈伤组织对潮霉素(Hyg)的敏感性试验

2.4农杆菌介导的遗传转化

2.5转基因植株的分子生物学检测

2.6 GUS组织化学染色

2.7转基因植株T1代的潮霉素抗性试验

2.8转基因植株T1代的稻瘟病抗性鉴定

2.9转基因材料的农艺性状调查

Ⅲ 结果与分析

1.不同外植体的愈伤组织胚性细胞诱导及保持

1.1各种诱导培养基对愈伤组织形成的影响

1.2不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导率的影响

1.3愈伤组织胚性细胞的保持

2.植株再生

2.1部分干燥处理对愈伤组织分化的影响

2.2不同分化培养基和不同激素配比对分化率的影响

3.潮霉素筛选浓度的确定

4.农杆菌介导的遗传转化与植株再生

5.转基因植株的鉴定

5.1 PCR鉴定

5.2 RT-PCR分析

5.3报告基因的检测

5.4转基因植株T1代潮霉素抗性分析

5.5 T1代植株的稻瘟病抗性

6.转基因水稻农艺性状考察

Ⅳ 讨论

1.籼稻愈伤组织再生体系的优化

2.农杆菌介导水稻愈伤组织转化体系的优化

2.1转化受体的选择

2.2菌液浓度对转化效率的影响

2.3共培养时间对转化效率的影响

2.4.筛选剂浓度的确立

3.转基因改良稻瘟病抗性

4.转基因水稻安全性评价

5.后续研究设想

参考文献

致谢

在读期间发表的论文情况