Ⅰ四川水稻立枯丝核菌的遗传分化与致病力研究;Ⅱ水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

摘要

水稻立枯丝核菌(R.solani)是丝核菌属(Rhizoctonia)的一个种，为半知菌亚门真菌，其分布广、寄主范围大，不产生无性孢子，常以菌核形态习居土壤，是玉米、水稻、草坪草、马铃薯等农作物和纹枯病的致病菌。根据菌丝融合与否，立枯丝核菌可划分为14个融合群(AG.1-AG-13和AG-BI)。1987年，Ogoshi等根据培养性状、寄主以及生理生化等特性分成不同的种内类群(Intraspecificgroup,ISG)，其中的一个融合群AG-1划分AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三个亚群。立枯丝核菌的AG-1IA亚群是水稻和玉米纹枯病的优势致病菌群，纹枯病在我国长江流域高温、高湿条件下年年发生，是水稻和玉米等农作物年年减产的主要因素之～。在四川，立枯丝核菌也造成水稻、玉米严重减产。因此，充分认识我省水稻立枯丝核菌(R-solani)生理小种变化的特点，进行综合防治立枯丝核菌，提高抗病育种水平显得尤其重要。 G蛋白是膜协同、异三聚体蛋白，由α、β、γ3个亚单位组成。G蛋白及其受体(GPCRs)组成了真核生物细胞里最流行的信号系统、感官多样调节系统、细胞生长和激素调节系统。G蛋白β亚基呈现出一种桶形β折叠结构，并包含WD40重复序列，其前端具有N端α螺旋，是G蛋白功能GTP连接转换器。Gilman等研究表明，在真核生物中G蛋白β亚基基因参与信号传导途径，导致基因表达、细胞功能受到影响。在很多能对植物致病的病原真菌，如Dictyosteliumdiscoideum、Ustilagomaydis和Fusariumoxysporum中，G蛋白在整个代谢生长过程中都起着举足轻重的作用，涉及细胞生长、分化和毒性等。Kasahara等对Cryphonectriaparasitica的研究发现，G蛋白β亚基基因功能丧失转基因菌株的菌丝缺乏明显分叉，对植物侵染和致病力明显降低。 本研究从四川不同生态区分离到水稻立枯丝核致病菌55株，研究其遗传分化、致病力分化和聚类分析，并利用同源克隆方法分离水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因，对其功能做了些初步的研究，为研究水稻立枯丝核菌致病机理和对应防治方法奠定基础。实验主要结果如下： 1.通过水琼脂分离法共得到水稻立枯丝核菌菌株55株。 2.水稻立枯丝核菌菌丝融合：所有分离全部菌株中除D42都与标准菌株AG-1IA发生菌丝融合。部分菌株不仅仅能与其中的一种标准菌株发生菌丝融合，而且还能同时与其它一种或者多种标准菌株发生菌丝融合，这说明在细胞学水平上，这些立枯丝核菌具有多个菌群归属性，因此这类立枯丝核菌为桥梁菌群。 3.水稻立枯丝核菌致病力鉴定：室内采用离体叶片接种法，分别接种X400、蜀恢527R、蜀恢881R。结果表明，各菌株间致病力差异显著。田间采用始穗期嵌入接种法，结果表明，各菌株间致病力差异显著。同时发现，相同菌株同时接种三种材料时，室内离体鉴定方法的致病力对不同材料差异较小，而活体接种方法表现出很大的材料间差异。 4.RAPD分子标记聚类分析：结果显示，在相似系数0.91处，除D42、D54以外的所有分离菌株与AG-1IA可聚为一类，而外群对照菌株A-1和另外9个国际标准菌株分别归属一类。以相似系数0.941为标准，可以把55个水稻立枯丝核菌菌株为8类：D1、D35、D6等40个为第1类；D36、D39、D40、D46、D41为第2类；D7和D20第3类；D37和D50为第4类；D2和D3为第5类；D47和D55为第6类；D42为第7类；D54为第8类。 5.水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的同源克隆：利用衍生自T.cucumerisG蛋白β亚基基因序列的特异引物，对水稻立枯丝核菌菌株DNA进行PCR扩增。产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可以观察到一条约1.9kb大小的扩增带，与预期的G蛋白β亚基基因大小相吻合。经测序表明该片段为水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的扩增产物。softberry软件分析证实，该序列包含一个约1.7kb的完整开放阅读框，编码366个氨基酸。 6.G蛋白beta亚基基因多态性及进化分析：对11个水稻立枯丝核菌菌株的G蛋白β亚基基因氨基酸序列作同源性比较。结果发现，他们之间同源性较高，但是，在某些区间发生变异。进化分析发现该序列与大量物种G蛋白β亚基基因明显同源，一致性介于88.14-57.34％。 7.基因的表达模式分析：通过半定量RT-PCR法对水稻立枯丝核菌AG-1IAG蛋白β亚基基因在不同时期的表达量分析显示，水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在前2d几乎不表达，从第3天到第5天基因的表达量逐渐增大，在第5天时达到最大，第6天后表达量陡然降低到几乎不表达。因此，水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在对数生长期表达量最大，提示水稻立枯丝核菌AG-1IAG蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。

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论文说明：图表目录

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第一部分四川水稻立枯丝核菌的遗传分化与致病力研究

1文献综述

1.1立枯丝核菌发病历史和分布

1.2病症和损失

1.3病原菌

1.4生理学

1.5生物化学技术在菌丝融合群研究中的应用

1.6 DNA分子标记技术在菌丝融合群研究中的应用

1.7病害流行因素

1.8 防治

1.9开题设想

2材料与方法

2.1材料

2.2立枯丝核菌的鉴定标准

2.3立枯丝核菌培养基和接种技术规程

2.4四川不同地区水稻立枯丝核菌株的分离

2.5菌丝融合实验

2.6致病力鉴定

2.7菌株DNA的提取

2.8 RAPD分析

2.9试验方法

2.10数据统计和分析

3结果与分析

3.1四川生态区菌株分离结果

3.2菌丝融合

3.3致病力鉴定

3.4 RAPD分析

3.5聚类分析

4讨论

4.1四川水稻立枯丝核菌多样性与致病力关系

4.2菌丝融合、致病力鉴定与RAPD聚类关系

4.3关于接种方法

4.4关于“桥梁分离物”菌株

参考文献

第二部分水稻立枯丝核菌（R.solani）G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

1文献综述

1.1 G蛋白基本结构和种类

1.2 G蛋白偶联的信号传导系统及各组分的结构和功能

1.3 G蛋白偶联信号传导系统在植物保护方面的研究

1.4 G蛋白基因克隆及基因工程

1.5 G蛋白β亚基基因研究

1.6丝状真菌G蛋白β亚基基因研究

1.7开题设想

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1水稻立枯丝核菌RNA的提取结果

3.2 G蛋白β亚基基因克隆

3.3水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因氨基酸序列同源分析

3.4 G蛋白β亚基基因氨基酸序列的系统进化树分析

3.5水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的差异表达

4讨论

4.1水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因克隆

4.2氨基酸序列特征分析

4.3 AG-1IA G蛋白β亚基基因表达

参考文献

附录

致谢

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