猕猴溶组织内阿米巴原虫病病原分离鉴定及凝集素hgl基因的原核表达

摘要

本研究从猕猴阿米巴病例的腹泻粪样中分离到一株阿米巴原虫，该原虫经过实验室的培养和形态学观察后，初步鉴定为溶组织内阿米巴或迪斯帕内阿米巴，采用鉴别溶组织内阿米巴和迪斯帕内阿米巴的虫种特异性引物，对阿米巴原虫peroxiredoxin基因进行PCR扩增，结果显示溶组织内阿米巴特异性引物扩增出了相应大小的DNA片断，经过克隆后测序，序列分析(登录号为：EU022309)显示本虫株与人溶组织内阿米巴株序列同源性为98％-99％，而与人迪斯帕内阿米巴株序列同源性仅为89％，鉴定该阿米巴猕猴分离株为溶组织内阿米巴，命名为EntamoebahistolyticaMH530株。 参照GenBank中收录的人溶组织内阿米巴原虫半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素的重链hg1基因序列设计一对引物，通过PCR扩增获得与预期相符的产物，经过克隆后测序，得到1761bp的有效基因序列。通过对该基因核苷酸序列和推导的氨基酸进行分析，结果表明核苷酸序列与人溶组织内阿米巴的序列同源性在93.44％-96.21％之间，与人迪斯帕内阿米巴的序列同源性为87.44％。该基因编码了一个有587个AA的多肽，分子量为65.514KD，等电点理论值为5.17，具有较强的亲水性，蛋白抗原性分析显示其抗原位点分布于整个蛋白质多肽链。该序列已登录在GenBank上(登录号为EU244479)。 根据获得的基因序列设计一对表达引物，对其中重要的含多个抗原决定簇的LC3段进行原核表达，制备目的基因和表达载体，将目的片断插入pET32b(+)表达载体上，将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用1.0mM/L的IPTG诱导表达了猕猴溶组织内阿米巴凝集素hg1基因LC3段，SDS-PAGE分析表明，在相对分子质量约66KD处出有明显的蛋白质表达条带，而对照组pET32b(+)空质粒菌在此处没有条带，该蛋白在3h时基本达到表达量最大值，而IPTG浓度在0.05mM/L和2.0mM/L之间没有明显表达差异，均都得到了很好的表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

第二章猕猴溶组织内阿米巴病原的分离培养及分子鉴定

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2实验结果

2.1粪检及接种培养

2.2形态观察

2.3虫种分子鉴定

3讨论

第三章溶组织内阿米巴凝集素基因hgl链LC3段的克隆与原核表达

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2试验结果

2.1hgl基因的克隆质粒的构建

2.2hgl基因的亚克隆

2.3hgl的LC3段基因重组表达质粒的构建与鉴定

2.4重组表达质粒的表达产物SDS-PAGE电泳

3讨论

4结论

参考文献

致谢

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