小麦种子蛋白及赤霉病抗性相关基因的分子鉴定

摘要

依据功能不同可将种子蛋白划分为贮藏功能的谷醇溶蛋白和维持正常代谢功能的非醇溶性蛋白两类。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)属于种子醇溶性蛋白，优质HMW-GS可明显改善小麦加工品质。小麦近缘属种中广泛存在的HMW-GS等位变异基因可能成为小麦品质改良的重要基因资源。麦类作物种子中还富含属于种子非醇溶性蛋白中清蛋白的α-淀粉酶抑制因子(AAI)，能有效抑制内源或外源α-淀粉酶活性，控制种子穗发芽、抑制昆虫繁殖。赤霉病是小麦主要病害之一，易感染开花期的小穗和发育早期的籽粒。赤霉菌会扰乱种子贮藏蛋白的合成或者消耗种子中的蛋白、糖来供自己繁殖，从而破坏发育中的籽粒。本文对小麦种子蛋白HMW-GS、AAI进行了基因克隆、与进化分析，并对抗赤霉菌材料的基因表达谱进行了分子鉴定，主要结果如下： 1.从二倍体长穗偃麦草中分离并鉴定了4个新型HMW-GS编码基因，分别编码x-型亚基(Ee2.1、Ee1.9)与y一型亚基(Ee1.8、Ee1.5)。其中，Ee2.1和Ee1.5各存在1个与普通小麦HMW-GS相比特殊的Cys，推测这两个亚基在小麦品质育种中具有潜在利用价值。对小麦族不同物种HMW-GS的N-端序列进行比对分析发现，x-型和y-型HMW-GS均具有很高的同源性，但y-型HMW-GS变异程度比x-型亚基小。依据是否存在15bp或24bp的碱基插入将x-型HMW-GS及其编码基因划分为3种类型。系统进化分析表明，HMW-GS编码基因在漫长的基因复制过程中相对独立，且一直保持着其生物学功能。来自普通小麦A、B、D基因组的HMW-GS存在明显差异，具有染色体组特异性。 2.从普通小麦及近缘物种中克隆获得与昆虫抗性有关的635个二聚α-淀粉酶抑制因子编码基因(WDAI)，377个单聚α-淀粉酶抑制因子(WMAI)和20个四聚α-淀粉酶抑制因子(WTAI)编码基因序列。对α-淀粉酶抑制因子序列与功能分析，探讨了该家族成员间的理化、功能(如等电点、迁移率、对蛋白酶的抑制范围和活性)差异的分子基础。建立了一种利用序列中SNP位点开发出特异标记引物将功能基因定位于普通六倍体小麦具体基因组的方法，由此将来自普通小麦的WDAI基因定位在3BS和3DS上。虽然从A基因组一粒系小麦中得到了WDAI、WMAI编码基因序列，但分子证据揭示普通小麦A基因组不含有WDAI编码基因，而是否含有WMAI编码基因则需要进一步研究。依据序列特征，推测小麦及其近缘物种中WDAI源于共同的祖先基因，而小麦及山羊草的WMAI也可能由一共同的祖先基因通过复制与突变进化而来，但是WMAI相似性明显比WDAI高，变异程度更低。 3.依据序列分析发现二倍体一粒系小麦由于碱基插入导致无α-淀粉酶抑制因子活性的分子基础。一粒系小麦中WDAI编码基因差异与基因组来源有关，与地理来源关系不明显。Am基因组的WDAI基因与Au基因组的基因相比进化速率更慢、变异程度更低。依据普通小麦B基因组和拟斯卑尔托山羊草组S(S、Sl、Ss、Ssh“和Sb)基因组159个WDAI基因序列中SNP位点差异，共发现59种呈“星”形分布的单倍型，并可归为5个主要的单倍型组。普通小麦和野生二粒小麦B基因组上的WDAI基因与来自拟斯卑尔脱山羊草S基因组上的WDAI基因最相似，但是推测多个拟斯卑尔托山羊草组物种可能通过种间杂交时的基因渐渗参与了多倍体小麦B基因组WDAI基因位点的形成。小麦族11个属20个基因组的WDAI基因的分子系统进化分析表明，WDAI编码基因差异与基因组系统进化有关，且在基因组分化以前该位点就已经存在。这些结果为深入了解WDAI基因位点上基因重组、整合事件及发生过程提供了重要信息，有助于加深对WDAI功能的了解。 4.对以色列野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子基因的遗传结构、分化程度及其与生态因子间的关系进行了系统研究。WMAI序列所包含遗传信息较低；WTAI序列同样非常一致。无论是在居群内还是居群间，野生二粒小麦WDAI基因位点都存在变异，居群间遗传距离与地理来源关系密切。野生二粒小麦WDAI基因序列ω值(Ka/Ks)大于1，表明该基因位点为正选择位点，存在明显的选择压力导致WDAI基因序列产生多样性及遗传和功能差异。WDAI编码基因中SNP标记所揭示的16个居群遗传多样性指数(P)、Nei’s基因多样性(He)和Shannon指数(I)分别为0.887、0.404和0.589。SNP服从于自然选择，生态因子单独或联合作用导致WDAI基因序列中SNP位点的多样性，特别是几个水分因子对SNP位点有极显著影响，推测水分作为主要选择压力通过影响昆虫数量间接影响α-淀粉酶抑制因子遗传结构变异、分化程度。 5.获得与过敏性哮喘相关的小麦种子潜在变应原编码基因。利用生物信息学手段对小麦种子蛋白质变应原与公认主要变应原α-淀粉酶抑制因子进行了比较，并预测编码蛋白质高级结构。由于过敏哮喘与由IgE介导的超敏反应有关，推测这些蛋白质具有能与IgE结合相似的结构域。 6.对一套中国春.长穗偃麦草附加系、代换系、端体异附加系材料的赤霉病抗性进行了评价，发现7E附加系(CS-7E)和7ES端体异附加系(CS-7ES)抗性最强，推测7E染色体上存在潜在的赤霉病抗性基因或能诱导/抑制普通小麦CS上抗性/易感基因表达的调控基因。利用基因芯片对CS、CS-7E、CS-7ES在赤霉菌诱导0-96小时后的表达谱进行了分析，初步筛选出70个赤霉病菌诱导差异表达的抗性相关基因：生物信息学比对和功能注解发现，候选基因所编码蛋白质或是属于某些特定的生理生化代谢途径关键酶、或是已知功能真菌诱导抗性应答蛋白、或与生物或非生物胁迫应答有关。利用实时定量PCR对16个候选基因的表达水平进行了验证，与芯片数据相比基因表达水平变化的方向(上调或下调)一致，但Q-PCR所检测到的差异要大于芯片所显示的表达差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1小麦种子中的重要贮藏蛋白

1.1.1小麦籽粒蛋白

1.1.2谷醇溶蛋白

1.1.3非醇溶性蛋白

1.1.4籽粒蛋白与环境的关系

1.1.5小麦籽粒蛋白引起的过敏性疾病

1.2 HMW-GS与小麦加工品质

1.2.1 HMW-GS及其编码基因的分子结构

1.2.2 HMW-GS编码基因的分子克隆

1.2.3HMW-GS与品质关系

1.3 α-淀粉酶抑制因子与昆虫抗性

1.3.1植物对昆虫的抗性

1.3.2 α-淀粉酶抑制因子

1.4 α-淀粉酶抑制因子与种子穗发芽

1.5赤霉菌及与其抗性相关的基因(种子部分)

1.5.1赤霉病概述

1.5.2赤霉菌蛋白酶及植物种子中的蛋白质抑制因子

1.6立题依据及主要研究内容

第2章小麦族物种HMW-GS及其编码基因的进化分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1植物材料

2.2.2 SDS-PAGE分析

2.2.3 DNA提取及PCR扩增

2.2.4 PCR片段克隆、序列测定与分析

2.2.5小麦族HMW-GS及其编码基因序列获得

2.2.6小麦族HMW-GS进化分析

2.3结果与分析

2.3.1长穗偃麦草HMW-GS的鉴定

2.3.2小麦族物种HMW-GS N-端序列比较

2.3.3进化分析

2.4讨论

2.4.1长穗偃麦草HMW-GS

2.4.2小麦族HMW-GS N-端序列

2.4.3不同基因组间HMW-GS序列差异

2.4.4小麦族物种HMW-GS进化

第3章小麦淀粉酶抑制因子基因SNP鉴定与标记开发及染色体定位

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1植物材料

3.2.2 α-淀粉酶抑制因子数据收集

3.2.3 DNA提取及PCR扩增

3.2.4序列分析

3.2.5基因组特异标记引物开发及染色体定位

3.3结果与分析

3.3.1 WDAI基因SNP鉴定及单倍型分析

3.3.2 WMAI基因SNP鉴定及单倍型分析

3.3.3 WTAI基因序列分析

3.3.4利用基因组特异SNP标记对WDAI基因进行染色体定位

3.4讨论

3.4.1小麦WMAI、WDAI、WTAI序列特征分析

3.4.2 WDAI分子鉴定

3.4.3 WMAI分子鉴定

3.4.4 WDAI基因染色体定位

第4章小麦族WDAI编码基因的序列多态性及进化分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1植物材料

4.2.2 PCR扩增与序列分析

4.2.3数据收集

4.2.4数据分析

4.3结果与分析

4.3.1二倍体小麦A基因组中WDAI基因的多态性分析

4.3.2小麦B基因组及山羊草S基因组中WDAI基因进化分析

4.3.3小麦族WDAI基因分析

4.4讨论

4.4.1二倍体小麦A基因组WDAI基因

4.4.2普通小麦B基因组与山羊草属S基因组WDAI基因

4.4.3小麦族WDAI基因

第5章生态环境因子与野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子基因SNP位点多态性的关系

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1野生二粒小麦材料及其生态背景

5.2.2 DNA提取及WMAI、WDAI、WTAI编码基因序列PCR扩增

5.2.3 WDAI编码基因位点特异标记开发

5.2.4数据获取及分析

5.3结果与分析

5.3.1野生二粒小麦WMAI、WDAI、WTAI编码基因序列分析

5.3.2 WDAI编码基因SNP位点和单倍型分析

5.3.3 WDAI编码基因SNP标记引物开发与鉴定

5.3.4 WDAI编码基因SNP标记揭示的遗传多样性

5.3.5环境变量与WDAI基因SNP位点的主成分分析及多元回归分析

5.3.6 WDAI基因SNP位点与生态因子间的等级相关分析

5.4讨论

5.4.1 WDAI编码基因序列中的SNP

5.4.2野生二粒小麦WDAI编码基因遗传多样性

5.4.3遗传距离与地理距离

5.4.4 WDAI编码基因生态遗传学

第6章小麦种子蛋白中引起面包师哮喘的主要变应原分子鉴定

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1植物材料

6.2.2面包师哮喘相关变应原数据获取及分析

6.2.3各潜在变应原的特异引物设计及PCR扩增

6.2.4蛋白结构与功能预测及比较

6.3结果与分析

6.3.1小麦种子贮藏蛋白中主要变应原的分子克隆及氨基酸序列分析

6.3.2变应原蛋白质二级结构预测及比较

6.3.3 3D结构预测

6.4讨论

第7章抗赤霉病中国春-长穗偃麦草7E附加系全基因组表达谱芯片分析

7.1前言

7.2材料与方法

7.2.1植物材料

7.2.2赤霉病抗性评价

7.2.3 RNA提取

7.2.4表达谱芯片对基因表达水平检测

7.2.5实时定量PCR(Q-PCR)分析

7.3结果与分析

7.3.1基因表达剖析

7.3.2依据表达水平对差异基因进行分等级聚类分析

7.3.3候选基因与已知抗性反应的关系

7.3.4荧光定量PCR验证

7.4讨论

7.4.1赤霉菌诱导的JA和SA途径基因表达

7.4.2其它应答基因

参考文献

致谢

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