猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立

摘要

猪支原体肺炎(MycoplasmaPneumoniaeofSwine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性接触性呼吸道传染病。主要症状及表现为咳嗽、气喘、饲料的利用率低，病猪生长十分缓慢，甚至生长停滞。该病以发病率高，死亡率低为其特点。而在临床上检测感染猪，仍面临困难。猪肺炎支原体的表面膜蛋白是该菌主要的免疫抗原，对猪肺炎支原体感染的诊断有重要意义。 本研究通过制备抗猪肺炎支原体高免血清，运用辛酸.硫酸铵盐析和阴离子交换层析技术，获得高活性、高电泳纯的IgG。再将纯化IgG与CNBr-activatedSepharose4B偶联制得抗Mhp-免疫亲和层析柱，以提取和纯化通过TritonX-100结合KI破碎的支原体细胞所获得的猪肺炎支原体膜蛋白。纯化的膜蛋白抗原经SDS-PAGE电泳分析，结果显示，纯化后的抗原蛋白分子的纯度显著提高，仅呈现66KD，48KD，46KD，40KD，32KD和24KD的6条清晰的蛋白条带，而未纯化的膜蛋白条带有11条，分子量范围在20KD-100KD之间。 本研究采用纯化的膜蛋白抗原建立了猪肺炎支原体的间接ELISA检测方法。试验确定的最适ELISA工作条件为：包被纯化抗原蛋白浓度5ug/ml，血清稀释度为1:80，封闭液为1.5％BSA，封闭时间120min，抗原抗体作用时间90min，酶标二抗SPA(1:1000稀释)作用时间为60min，阴阳性界限OD值为0.289。 分别用纯化抗原和粗提抗原包被ELISA板，对比二者的检测结果发现，纯化抗原对样品的阳性检出率比粗提抗原提高了7.5％。用建立的标准猪肺炎支原体ELISA检测方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试剂盒同时检测50份血清样品，二者总的符合率为92％。对临床送检的150份不同年龄段的猪血清样品，用该ELISA方法检测，结果显示，断奶前仔猪Mhp感染率为44.2％，保育猪为41.2％，育肥猪为17.9％。检测结果说明，猪肺炎支原体在猪群中广泛存在，也证明了建立的猪肺炎支原体EL,ISA检测方法在临床诊断中具有重要的实用价值。

目录

文摘

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声明

1.前言

1.1猪肺炎支原体及其危害性概述

1.2猪肺炎支原体的致病机理

1.2.1猪肺炎支原体荚膜致病性的研究

1.2.2猪肺炎支原体细胞膜致病性的研究

1.3猪肺炎支原体抗原蛋白的研究

1.4猪肺炎支原体诊断方法的研究进展

1.4.1临床与病理组织学诊断

1.4.2病原学诊断检测

1.4.3血清学检测

1.4.4分子生物学诊断检测

1.5本研究的目的意义

2.试验材料

2.1试验菌株、动物及血清

2.2 SDS-PAGE相关溶液

2.3 ELISA相关溶液

2.4亲和层析相关溶液

2.6主要仪器设备

2.7主要试剂

3.试验方法

3.1菌株培养及膜蛋白提取

3.1.1猪肺炎支原体的培养

3.1.2猪肺炎支原体膜蛋白的粗提取

3.2猪肺炎支原体免疫血清的制备

3.3猪肺炎支原体免疫血清的纯化

3.3.1免疫血清IgG的辛酸-硫酸铵盐析粗提

3.3.2应用High-Q阴离子交换层析对免疫血清的纯化

3.4膜蛋白的免疫亲和纯化

3.4.1免疫亲和柱的制备

3.4.2免疫亲和纯化膜蛋白

3.5猪肺炎支原体抗体检测ELISA方法的研究

3.5.1用纯化蛋白作为包被抗原的ELISA方法

3.5.2 ELISA试验条件的确定

3.5.3 ELISA阴阳界限的确定

3.5.4 ELISA的交叉反应试验

3.5.5纯化抗原与粗提抗原ELISA检测的比较

3.5.6 ELISA方法敏感性和特异性的检测

3.5.7 ELISA方法的重复性试验

3.5.8 ELISA方法的临床检测

4.试验结果

4.1免疫血清的纯化及鉴定

4.2膜蛋白的免疫亲和纯化

4.2.1亲和层析柱的制备

4.2.2膜蛋白的纯化

4.3 ELISA检测方法的研究

4.3.1抗原蛋白最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定

4.3.2封闭液和封闭时间的确定

4.3.3抗体作用时间的确定

4.3.4酶标SPA作用时间的确定

4.3.5 ELISA阴阳界限的确定

4.3.6 ELISA的交叉反应试验

4.3.7纯化抗原与粗提抗原ELISA检测的比较

4.3.8间接ELISA方法与IHA的比较

4.3.9间接ELISA的重复性试验

4.3.10间接ELISA的临床检测

5.分析讨论

5.1免疫血清：IgG的纯化

5.2猪肺炎支原体膜蛋白的提取

5.3膜蛋白的免疫亲和层析

5.4间接ELISA试验方法研究

5.5临床检测

6.结论

参考文献

致谢