禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究

摘要

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）血清型众多，不同血清型之间交叉保护力弱，而常规疫苗常引起lB的免疫失败。因此，从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗，对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上，本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测，筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段，构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因，将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法，构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒，并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究，为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。 1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位（主要是中和抗原表位）和T细胞表位（主要是CTL抗原表位），同时结合文献研究报道，共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7（S1：24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA； S2：1-65AA； N：1-120AA、N：290-410AA）。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列，3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序，分析表明，构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析，成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因，分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等，国内外未见报道，该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料，为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立，以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。 2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a（+），转化E．coli Rosetta，采用IPTG进行诱导，研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达，Western-blots显示，该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件，确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L，诱导时间为3h，诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板，筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL，抗体最佳稀释度1：40，酶标二抗（HRP标记兔抗鸡IgG）最佳稀释度1：3000，血清样品阴阳性临界值为0．133，建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究，表达产物有良好免疫反应活性，建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法，该方法安全、灵敏度高（血清稀释度可达1：300）、特异性强，优于常规的IBV抗体检测方法，国内外未见报道，为IBV抗体的检测提供了新的方法。 3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3．1、pVAX1、VR1020中，构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3．1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后，通过脂质体转染COS-7细胞，利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明，转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段；间接免疫荧光检测表明，转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒，检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性，国内外未见报道，为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。 4、采用本课题组获得专利（专利授权号为200410081443．4）的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒，将纯化的重组质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗，通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡，21日龄加强免疫一次，二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价，二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率；同时对pVAXl-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示：pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d，与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显著（P<0．01），但组间差异不显著。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d，与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显著（P<0．05）。ELISA抗体效价结果显示：pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d，与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显著（P<0．01），但组间差异不显著。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d，与pcDNA-F疫苗组相比差异均显著（P<0．05）。攻毒结果表明，pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80％、80％和75％，前两者优于常规灭活疫苗（75％）。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85％、90％和85％，表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-B和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示，pVAX1-F免疫接种后24h，在血液和所有检测的组织中检测到质粒，免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒；纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性，未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗，研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫，免疫鸡攻毒保护率为80％，高于常规IBV灭活疫苗（75％）；与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90％；该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好，未检测到与宿主基因组整合的现象。 本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究，在国内外未见报道，该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

选题背景

1.禽传染性支气管炎研究概况

2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况

3.多表位DNA疫苗的研究概况

4.CpG作为免疫佐剂的研究进展

5.细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展

本研究前期工作基础

存在的主要问题

本研究的内容及目的意义

本研究的技术路线

第一章禽传染性支气管炎病毒S1、S2、N蛋白抗原表位预测筛选及多表位嵌合基因克隆

摘要

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3.结果

3.1 IBV S1、S2、N蛋白B细胞抗原表位的预测结果

3.2 IBV S1、S2、N蛋白T细胞抗原表位的预测结果

3.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因片段的选择及合成

3.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接结果

3.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的鉴定结果

3.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因的结构特征分析

4.讨论

4.1 关于IBV的免疫机理

4.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的分析及选择

4.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位的获取及嵌合基因的拼接

4.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的构建策略

4.5 IBV S1、S2、N蛋白多抗表位嵌合基因F的生物信息学特征

5.小结

第二章禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因原核表达及ELISA方法的建立

摘要

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3.结果

3.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体pET-32a-F的鉴定

3.2 IBV 多表位嵌合基因表达产物的SDS-PAGE及Western-blots

3.3 IBV多表位嵌合基因原核表达诱导时间、浓度、温度的筛选

3.4 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布及纯化

3.5 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立

4.讨论

4.1 IBV多表位嵌合蛋白的表达系统

4.2 IBV多表位嵌合蛋白表达条件的优化

4.3 IBV多表位嵌合蛋白的回收及活性

4.4 关于IBV多表位嵌合蛋白的间接ELISA方法

5.小结

第三章禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗构建及真核表达检测

摘要

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3.结果

3.1 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒的鉴定

3.2 pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-18 质粒的鉴定

3.3 IBV多表位嵌合基因及鸡白介素真核表达转录产物RT-PCR检测

3.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒表达产物的间接免疫荧光检测

4.讨论

4.1 关于多表位DNA疫苗

4.2 不同真核表达载体于体外表达IBV多表位嵌合基因

4.3 关于IBV多表位嵌合基因真核表达质粒的体外转染

4.4 影响外源基因体外表达的因素

4.5 IBV结构蛋白多表位嵌合基因的体外表达的检测

5.小结

第四章禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗配制和免疫研究

摘要

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3.结果

3.1 质粒的鉴定

3.2 脂质体的转染效率检测

3.3 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗免疫原性测定

3.4 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗免疫原性测定

3.5 攻毒实验结果

3.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测

4.讨论

4.1 DNA疫苗的配制和免疫

4.2 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗的免疫效果

4.3 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫效果

4.4 关于攻毒保护性试验

4.5 关于DNA疫苗的分布和整合可能性

5.小结

结论

文献综述

1.禽传染性支气管炎研究概况

2.IBV抗原表位研究进展

3.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况

4.表位疫苗研究进展

5.CpG研究进展

6.鸡白细胞介素1β、2、18作为基因佐剂的研究进展

7.DNA疫苗在动物体内的分布研究进展

8.外源质粒DNA整合到宿主基因组的研究进展

参考文献

致谢

附录:英汉缩略名词对照表

在读博士期间发表的论文情况