副猪嗜血杆菌不同血清型外膜蛋白的免疫原性的研究

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPs）是引起猪Glasser’s病的病原体，HPs外膜蛋白（OMP）是副猪嗜血杆菌的毒力因子。本实验进行了副猪嗜血杆菌OMP的提取及其免疫原性的研究，为进一步研究副猪嗜血杆菌的OMP亚单位疫苗奠定了基础。 1、HPs外膜蛋白的提取及浓度测定 为研究副猪嗜血杆菌OMP的免疫原性，本试验选用副猪嗜血杆菌标准株血清1型、4型、5型、12型和13型，采用超声波破碎和十二烷基肌氨酸盐（SLS）提取副猪嗜血杆菌OMP，并用核酸蛋白仪测定了副猪嗜血杆菌OMP浓度，利用SDS-PAGE电泳检测，免疫印迹实验分析其免疫反应性。核酸蛋白仪检测副猪嗜血杆菌血清1型、4型、5型、12型和13型的外膜蛋白的浓度分别为58.3mg/ml、17.1mg/ml、34.7mg/ml、63mg/ml、28.7mg/ml。免疫印迹检测后发现HPs外膜蛋白具有良好的免疫反应性。 2、HPs外膜蛋白免疫原性的研究 制备油乳剂OMP免疫抗原和全菌灭活苗，对6周龄昆明鼠分别以OMP10ug/只、20ug/只、40ug/只、80ug/只的剂量皮下接种，全菌灭活苗则以0.2ml/只皮下接种，用ELIASA方法检测小鼠抗体水平变化。结果表明：副猪嗜血杆菌全菌灭活苗和OMP免疫抗原对昆明鼠均有较强的免疫原性，首免后7天可检测到OMP阳性抗体。副猪嗜血杆菌血清1型OMP最佳免疫剂量为80ug时效果最好，攻毒保护率达到100％；全菌灭活苗攻毒保护率为70％。副猪嗜血杆菌血清4型OMP最佳免疫剂量为80ug效果最好，攻毒保护率为80％；全菌灭活苗攻毒保护率为60％。血清5型OMP最佳免疫剂量为40ug、80ug时效果最好，攻毒保护率均为80％，表明血清5型的OMP在40ug时能给小鼠提供较好的保护；全菌灭活苗攻毒保护率为80％。血清12型OMP的最佳免疫剂量为40ug时效果最好，攻毒保护效率为90％；全菌灭活苗攻毒保护率为90％。血清13型OMP剂量为80ug时免疫效果最好，攻毒保护率为80％；全菌灭活苗攻毒保护率为80％。通过全菌灭活苗与OMP抗体水平检测和攻毒保护的相关测试，发现OMP具有较好的免疫原性，是副猪嗜血杆菌的重要保护性抗原。本试验结果将为副猪嗜血杆菌OMP快速诊断试剂盒的研制、亚单位疫苗的开发奠定良好的基础，并为该病的有效防制奠定了重要基础。

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文献综述

1. 副猪嗜血杆菌研究现状

2. 细菌外膜蛋白的研究现状

3. 研究目的和意义

材料方法

1 实验材料

1.1 试验菌株与血清

1.2 主要试剂

1.3 实验动物

1.4 主要仪器

2. 实验方法

2.1 HPs的复苏与培养

2.2 HPs外膜蛋白的提取

2.3 HPs外膜蛋白浓度测定

2.4 HPs外膜蛋白的鉴定

2.5 HPs外膜蛋白对小鼠免疫原性研究

结果

1. HPs镜检形态

2. HPs外膜蛋白浓度测定结果

3. HPs外膜蛋白的鉴定结果

3.1 HPs外膜蛋白的SDS—PAGE电泳检测结果

3.2 HPs外膜蛋白的反应原性检测结果

4. 疫苗检验结果

4.1 疫苗的无菌检验

4.2 疫苗安全性检验

4.3 疫苗的稳定性

5. HPs对外膜蛋白的免疫原性研究

5.1 HPs最小致死量的测定结果

5.2 HPs外膜蛋白免疫保护率的测定

5.3 间接ELISA条件选择

5.4 OMP抗体测定

讨论

结论

参考文献

致谢

附录：实验试剂的配置