大熊猫和川西猕猴胃肠道寄生虫研究

摘要

野生动物是宝贵的自然资源，保护野生动物是全人类的共同责任。大熊猫属世界濒危物种，川西猕猴为我国二级保护动物。胃肠道寄生虫是这两种动物体内最常见、危害最严重的一类寄生虫。 在大熊猫寄生虫病中，蛔虫病是严重威胁大熊猫种群的主要寄生虫病，野外大熊猫的蛔虫感染率可达50％-100％，是导致野生大熊猫发生死亡的主要因素之一。对动物蛔虫进行准确的分类鉴定是开展蛔虫生物学及防治等研究的基础性工作。目前，对寄生于大熊猫蛔虫的分类地位尚存在一定的争议。过去对动物蛔虫的分类鉴定主要依赖于形态与生物学方法。由于宿主与地理环境等因素所导致的遗传变异，传统的形态与生物学分类研究方法在一些蛔虫近缘种的分类鉴定中的局限性日益明显。长期以来，大熊猫等野生动物蛔虫病的防治均以药物驱虫为主，但驱虫药物均不同程度地存在副作用且长期使用可能产生抗药性等问题，因此也需要研究新的防治技术。为了更好地防治野生动物蛔虫病，本研究扩增出了大熊猫和小熊猫等8种野生动物蛔虫线粒体基因（COXⅠ，COXⅡ），从而为以形态学为基础的传统分类提供DNA分子水平的依据。同时，通过PCR扩增出大熊猫西氏贝蛔虫抗原基因Bs-Ag3，对其进行克隆、表达和免疫保护试验，从而为研制西氏贝蛔虫基因工程疫苗提供候选抗原。 猕猴作为医学生物学研究领域中日益广泛使用的实验动物，由于其进化史与人类亲缘关系最接近，因此是研究人类健康和疾病的理想动物模型。而猕猴寄生虫的感染不仅严重影响动物饲养繁殖以及实验动物标准工作，而且直接关系到科学试验结果的准确获得。进行野外捕获猕猴胃肠道寄生虫的调查研究和驱虫药的临床药效学评价，对野生和圈养猕猴种群的健康和紧急疾病的防控均有着重要意义。本研究对在四川野外捕获的川西猕猴胃肠道寄生虫进行了流行病学调查，并评估了塞拉菌素、伊维菌素和甲苯咪唑对猕猴胃肠道寄生虫的驱杀效果。 本论文的主要研究工作和结果如下： 1．大熊猫等八种野生哺乳动物蛔虫的线粒体COXⅠ，COXⅡ基因序列分析 为了探讨寄生于大熊猫、小熊猫、北极熊、棕熊、马熊、四川黑熊、黑猩猩和白眉长臂猿体内寄生蛔虫的分类地位，采用PCR技术扩增了这些野生动物寄生蛔虫的线粒体COXⅠ，COXⅡ基因序列并与GenBank中注册的12个相似序列进行了分析。序列分析结果显示：扩增的8种野生哺乳动物蛔虫的COXⅠ基因序列均为393bp，其中大熊猫与小熊猫及4种熊科动物蛔虫COXⅠ基因序列的同源性为94．8％-95．0％，黑猩猩和白眉长臂猿蛔虫COXⅠ基因序列的同源性为99．8％；扩增的8种野生哺乳动物蛔虫的COXⅡ基因序列均为582bp，大熊猫与小熊猫及4种熊科动物蛔虫COXⅡ基基因序列同源性为94．9％-95．5％，黑猩猩和自眉长臂猿蛔虫COXⅡ基基因序列同源性为99．5％。根据同源性分析及构建的UPGMA分子系统树表明：寄生在大熊猫、小熊猫和4种熊科动物体内的蛔虫均为贝蛔属蛔虫（Baylisascaris）；而黑猩猩和白眉长臂猿体内寄生的蛔虫应为蛔属蛔虫（Ascaris）。同时，分析结果也揭示了蛔虫与宿主之间存在协同进化关系。 2．大熊猫西氏贝蛔虫Bs-Ag3基因的克隆、表达与免疫保护试验 对大熊猫西氏贝蛔虫Bs-Ag3基因进行了PCR扩增、克隆和测序，序列分析表明该基因开放阅读框长966bp，共编码321个氨基酸，无信号肽，分子量35．543，理论pI=4．76。通过BLAST分析发现，Bs-Ag3基因与猪蛔虫As37基因同源性达91％。将构建的pET32a（+）一Bs-Ag3表达载体转化表达宿主菌BL21（DE3）进行原核表达，经Western-blot分析表明，纯化的重组蛋白（rBs-Ag3）能被兔抗西氏贝蛔虫阳性血清识别。纯化的重组蛋白与弗氏完全佐剂（FCA）混合液接种免疫小鼠后，3次免疫后用西氏贝蛔虫感染性虫卵攻击小鼠，结果发现rBs-Ag3-FCA组比对照组西氏贝蛔虫幼虫减少了62．91％（P<0．01），小鼠血清中IgG抗体显著升高（P<0．01）。本研究表明Bs-Ag3基因可作为西氏蛔虫基因工程疫苗的候选基因。 3．川西猕猴胃肠道寄生虫的调查 采用循序沉淀法和饱和盐水漂浮法对川西地区（甘孜州的九龙县、小金县、绵阳市北川县和雅安市汉源县）野外捕获的714只川西猕猴进行了胃肠道寄生虫的检查，共检测出10种胃肠道寄生虫，分别为Entamoeba spp．（49．3％），Strongvloides fulleborni（47．2％），Trichuris trichiura（33．1％），Balantidium coli（18．5％），Oesophagostomum sp．（16．2％），Giardia duodenalis（7．4％），Enterobius sp．（1．5％），Dicrocoeliidae sp．（0．7％），Ascaris sp．（0．6％）和Bertiella sp．（0．3％）。使用卡方（x2）检验对不同年龄、性别和地区的猕猴寄生虫感染情况进行分析。结果显示：幼体和成体猕猴的线虫感染率均显著高于亚成体猕猴，原虫感染方面Balantidium coli随着年龄的增长感染率有增高的趋势，而Giardia duodenalis的感染率随着年龄的增长有着减轻的趋势；雌性猕猴的线虫感染略高于雄性，而不同性别猕猴的原虫感染均无统计学差异；4个地区的线虫感染率都较高，均高于50％，其中北川县最高，达82．2％，除北川县的原虫感染率为39．7％外，其他3个县的感染率均达55％以上。 4．塞拉菌素、伊维菌素和甲苯咪唑对川西猕猴胃肠道线虫的驱虫试验 将60只川西猕猴幼猴随机分为4组，除空白对照组外分别使用塞拉菌素（外用透皮剂，一次用药，6 mg/kg）、伊维菌素（注射剂，一次用药，0．3 mg/kg）和甲苯咪唑（片剂，连续5次用药，40 mg/kg）对幼猴进行胃肠道线虫驱杀试验。于驱虫前3天和驱虫后第11天采粪样进行虫卵EPG计数，并通过计算虫卵减少率评估药效。结果表明，塞拉菌素、伊维菌素和甲苯咪唑均能有效驱杀幼猴体内胃肠道线虫，虫卵减少率分别为99．4％，99．4％和99．2％，且三种驱虫药药效之间并无显著差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

一、大熊猫寄生虫研究进展

1 大熊猫的寄生虫种类

2 大熊猫的主要寄生虫病

3 结语

二、猕猴胃肠道寄生虫研究进展

1 猕猴胃肠道寄生虫种类

2 猕猴胃肠道寄生虫流行病学

3 猕猴的胃肠道寄生虫防治

三、本试验的目的和意义

第二部分 研究内容

第一章 大熊猫等八种野生哺乳动物蛔虫的线粒体COXⅠ，COXⅡ基因序列分析

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第二章 大熊猫西氏贝蛔虫Bs-Ag3 基因的克隆、表达与免疫保护试验

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第三章 川西猕猴胃肠道寄生虫的调查

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第四章 塞拉菌素、伊维菌素和甲苯咪唑对川西猕猴胃肠道线虫的驱虫试验

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第三部分 结论

1.大熊猫、小熊猫蛔虫的分子分类研究

2.大熊猫蛔虫抗原基因的克隆、表达与免疫保护研究

3.川西猕猴胃肠道寄生虫的流行病学调查研究

4.三种驱虫药对川西猕猴胃肠道线虫的驱虫效果研究

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文