猪前脂肪细胞诱导分化前后SSH文库的构建及差异表达基因的筛选鉴定

摘要

前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化了的前体细胞，对其增殖和分化机理的深入研究有助于了解细胞脂肪沉积的调控机理，为提高畜禽品质乃至人类的肥胖及Ⅱ型糖尿病的治疗均有较大的指导意义。本论文的研究内容包括：
　　 1、以2日龄仔猪皮下脂肪组织为材料，采用胶原酶消化法分离培养出细胞成分均一、增殖旺盛的原代前脂肪细胞，经生长动力学研究发现所培养细胞接种后的潜伏期约为40h，倍增时间约为61.9h；经核型分析认为所培养细胞为稳定的二倍体细胞系。通过组织块培养法发现极易漂浮的脂肪组织通过悬浮培养也能获得原代培养细胞，用吸管吹打悬浮的组织块能加速组织块中的细胞游离出来。
　　 2、用M1、M2和M3三种不同诱导分化培养液（以DMEM/F12+100IU/mL双抗+50nmol/LIn+100nmol/LDEX+0.25mmol/LIBMX为基础，M1补加10％FBS,M2补加10％FBS和100nmol/L RSG,M3补加100nmol/L RSG)对前脂肪细胞进行诱导分化，通过分化过程中细胞形态学观察发现M2在诱导分化后的第2天大多细胞内均有小脂滴出现，而M1和M3在诱导分化后第3天部分细胞开始出现小脂滴，在脂肪积聚速度和脂滴汇聚快慢上以M2最快，M3次之，最慢的是M1;通过分化过程中细胞内脂肪含量测定发现采用M2诱导分化的细胞细胞内脂肪含量最多、增速最快，其次是M3,M1最少，与形态学观察结果一致。通过上述试验结果可知分化培养液M2对前脂肪细胞的诱导分化效果最好。
　　 3、在M1、M2和M3三种不同诱导分化培养液对前脂肪细胞进行诱导分化过程中，于11个不同分化时间点分别提取三种细胞的总RNA，借助实时荧光定量PCR检测了PPARα、PPARγ、C/EBPα、FASN、GPAT、FABP4、ACOX1、GAPDR和ENPP2等基因的表达变化趋势。通过比较M1和M2中各基因的表达变化发现罗格列酮对PPARγ、C/EBPα、FASN、GPAT、FABP4、ACOX1和GAPDH等基因的表达有极显著的上调作用(P＜0.01)，且能促进各基因协同表达达到表达高峰，而对PPARα和ENPP2两基因的表达有极显著的抑制作用(P＜o.01)；通过比较M2和M3中各基因的表达变化发现血清对PPARα、C/EBPα、FASN、GPAT、ACOX1、GAPDH和ENPP2等基因的表达有极显著的抑制作用(P＜0.01)，而对PPARγ和FABP4两基因的表达有极显著的促进作用(P＜0.01)；通过比较M1、M2和M3中各基因表达量变化趋势的相关系数发现PPARγ在前脂肪细胞的分化调控中发挥作用较早，继而作用于C/EBPα，再对下游相关生脂基因进行调控和激活；通过比较参与脂肪酸生物合成的FASN和参与脂肪酸β氧化的ACOX1两基因在三种培养液中表达量的变化趋势发现细胞内脂肪酸的生物合成和脂肪酸β氧化均在进行，以维持细胞内环境的稳定，细胞内聚脂快慢取决于脂肪酸生物合成和脂肪酸β氧化两个不同生物进程的力量对比。
　　 4、采用聚脂最快的分化培养液M2对前脂肪细胞进行诱导分化，于分化前和分化后分别提取细胞总RNA，构建前脂肪细胞诱导分化前、后抑制消减杂交文库。以分化前细胞所获cDNA为Driver，以分化后细胞所获cDNA为Tester构建的文库的消减效率为210（记为SSH-1），反向文库的消减效率为25（记为SSH-2）。其中SSH-1文库第二次PCR产物纯化后和载体PMD18-T连接，经蓝白斑筛选到3840个克隆；SSH-2筛选到2880个克隆。随机从SSH-1文库选取了960个克隆，从SSH-2文库选取了672个克隆经过PCR扩增鉴定，SSH-1文库得到797个条带单一的阳性克隆，SSH-2文库得到536个条带单一的阳性克隆，有效阳性率分别为83.0％和79.8％。从SSH-1文库的797个阳性克隆中选取了400个插入片断在150bp～700bp的单克隆，从SSH-2文库的536个阳性克隆中选取了150个插入片断在150bp～700bp的单克隆进行斑点杂交，SSH-1文库筛选出221个呈明显差异表达的阳性克隆，SSH-2文库筛选出73个呈明显差异表达的阳性克隆，斑点杂交后的阳性率分别为55.3％和48.7％。对所有通过斑点杂交筛选的阳性克隆进行序列测定，SSH-1文库共获得183个EST,SSH-2文库共获得63个EST。
　　 5、对测序所获246个EST序列（其中SSH-1共183个，SSH-2共63个）经载体、接头去除，单机BLAST比对去除重复EST序列，再通过NCBI的mRNA参考序列数据库(refseq_rna)、非冗余核酸数据库(nr/nt)和猪的EST数据库进行序列比对，SSH-1文库共获得130个己知基因，10个己知EST；SSH-2文库共获得15个已知基因，8个己知EST和1个全新EST，并将195条无重复EST向dbEST数据库进行了提交。
　　 6、利用已知基因对应的人参考mRNA序列的Genebank登陆号，通过Panther和DAVID两个在线基因功能注释系统对SSH-1文库的130个已知基因和SSH-2文库的15个已知基因进行了基因功能注释。通过Panther的基因功能注释，SSH-1文库的130个己知基因中参与信号转导/细胞间通信的基因有22个，占16.9％；参与细胞结构/运动的基因有10个，占7.7％；参与细胞凋亡的有3个（1个凋亡基因，2个抑制凋亡基因），占2.3％；参与免疫防御的基因有16个，占12.3％；参与物质转运的基因有19个，占14.6％，其中参与脂类和脂肪酸转运的基因有7个(LPL,NPC2,ABCD3,APOE,SCARB1.OSBPL9和FABP4)，占所有基因的5.4％，占参与物质转运基因的36.8％;参与转录、翻译与表达调控的基因有31个，占23.8％，其中参与脂肪酸生物合成的基因有2个(FA.SN和LTA4H)，参与脂类、脂肪酸和类固醇代谢调控的基因1个(ADRP)；参与物质代谢的基因有42个，占32.3％，其中参与脂肪酸脱饱和的基因有1个(CYB5R3)，参与脂肪酸β氧化的基因有3个(DECR1,ACOX1和ECHS1)，参与脂肪酸代谢的基因有6个(CRAT,SCD.AACS,ADIPOR1,CYP4F3和ANXA8)，参与脂类代谢的基因有5个(LTA4H,DGAT2,ADIPOR1,OSBPL9和PIGH)，参与磷脂代谢的基因有2个(MTMR3和PIGH)，参与类固醇代谢的基因有3个(CYP4F3,OSBPL9和PPAP2B),参与胆固醇代谢的基因有1个(ECHS1);参与细胞增殖和分化的基因有10个，占7.7％,其中参与细胞周期控制的有3个(YWHAQ,BTG1和CDK8)，参与细胞增殖和分化的有7个(PTMA,IL8,PCNA,BTG1,KHDRBS1,PA2G4和PGHS-2);此外，Panther上未分类的基因有22个，占16.9％，参与其它生物学进程的基因有18个，占13.8％。同时，部分基因具有多种功能，参与多种生物学进程。在SSH-2文库所分离出的15个已知基因中，参与信号转导/细胞间通信的基因有7个，占46.7％；参与细胞结构/运动、翻译与表达调控及Panther上未分类的基因均有2个，各自占13.3％；参与细胞凋亡和免疫防御的均有1个，各自占6.7％；参与物质转运的基因有3个，占20％；参与其它生物学进程的基因有5个，占33.3％。同时，部分基因具有多种功能，参与多种生物学进程。
　　 7、利用DAVID的在线功能相关基因聚类分群系统对功能相关基因进行了聚类分组，SSH-1文库130个基因共得到21个功能相关聚类群，SSH-2文库15个基因共得到3个功能相关聚类群。
　　 8、对Genebank上还未公布猪的mRNA序列的91基因(SSH-1共82个，SSH-2共9个)，利用相应EST和猪的dbEST数据库通过末端延伸法共拼接出包括全部CDS序列的69个基因的mRNA序列(SSH-1共64个，SSH-2共5个)。

目录

文摘

英文文摘

高频词对照表

第一章 文献综述

1 动物细胞体外培养技术

1.1 细胞体外培养技术的发展历程

1.2 体外细胞建系的方法

2 前脂肪细胞的培养与分化

2.1 前脂肪细胞理论的形成

2.2 前脂肪细胞的培养

2.3 前脂肪细胞的诱导分化

3 实时荧光定量PCR的数据分析

3.1 绝对定量

3.2 相对定量

4 差异表达基因的筛选、分离与鉴定

4.1 差异表达基因的筛选方法

4.2 基因功能分类的方法

4.3 电子克隆

5 本研究的目的意义

参考文献

第二章 猪前脂肪细胞系的建立及生长动力学研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 原代培养猪前脂肪细胞的形态学观察

3.2 猪前脂肪细胞的传代培养

3.3 猪前脂肪细胞冻存前和复苏后存活率的测定

3.4 猪前脂肪细胞的生长曲线

3.5 核型分析

4 讨论

4.1 关于猪前脂肪细胞的原代培养

4.2 传代培养与胰酶消化

4.3 猪前脂肪细胞的生长特性

4.4 前脂肪细胞系的鉴定

4.5 关于微生物污染检测

参考文献

第三章 猪前脂肪细胞的诱导分化和聚脂相关基因表达模式研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 猪前脂肪细胞分化过程中的形态学观察

3.2 前脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量测定

3.3 聚脂相关基因的表达模式

4 讨论

4.1 诱导分化后细胞的形态学观察比较

4.2 细胞内脂肪含量测定

4.3 基因表达检测（以11个时间点为基准进行讨论）

4.4 关于基因表达检测的时间点选择

5 小结

参考文献

第四章 猪前脂肪细胞诱导分化前后差异表达基因的筛选和鉴定

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 诱导分化前后细胞总RNA的提取及检测

3.2 mRNA的分离纯化

3.3 抑制消减杂交

3.4 斑点杂交

3.5 差异表达克隆序列测定

3.6 EST序列同源性比对及EST分类

3.7 已知基因的功能分类

3.8 相关基因的电子克隆

4 讨论

4.1 关于mRNA的质和量

4.2 关于RsaⅠ酶切消化

4.3 关于接头的连接效率

4.4 关于消减效率检测

4.5 关于斑点杂交筛选阳性差异表达克隆

4.6 关于EST序列的同源性比对

4.7 关于基因功能分类

4.8 关于电子克隆

参考文献

第五章 结论与展望

1 本文研究总结

2 下一步研究的方向和思路

参考文献

致谢

博士在读期间发表的论文