雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究

摘要

雏鹅新型病毒性肠炎(newtypegoslingviralenteritis，NGVE)是一种主要发生于30日龄以内的雏鹅的一种以小肠出血性、纤维素性、渗出性、坏死性炎症为特征的急性传染病。经流行病学调查、病理剖解、病原的分离、初步鉴定、病毒提纯与负染电镜观察其形态学特征、及病毒结构蛋白分析等一系列研究，初步认为该病是由禽腺病毒引起的雏鹅的一种新型病毒性肠炎。该病目前对养鹅业带来了巨大的经济损失。关于鹅腺病毒，特别是致病的鹅腺病毒，目前国内外的研究资料很少。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法，它在病毒学研究中具有不可替代的作用。本研究首先将NGVEV鹅胚尿囊液适应10日龄鸭胚，再将NGVEV鸭胚尿囊液适应体外培养的鸭胚成纤维细胞(DEF)，并对病毒在感染鸭胚体内及DEF细胞上的形态特征和病毒形态发生学进行系统地研究，同时观察被感染宿主细胞的超微结构病变和细胞凋亡的情况，以期了解NGVEV的入侵、分布及释放特点，为揭示该病毒致宿主细胞病变的机制提供科学依据。
　　 通过人工感染NGVEV-CN强毒而复制出NGVE急性病例，建立并利用间接免疫酶组织化学SP法及间接免疫荧光抗体法探究NGVEV对感染雏鹅组织的侵染特点及病毒抗原随感染时间延伸在宿主体内的动态分布规律，同时对病毒诱导雏鹅宿主的细胞凋亡进行检测，以期为阐明该病的发病机制提供实验数据及为NGVEV的实验室诊，断提供科学的方法。
　　 将制备的NGVEV灭活疫苗及添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅，对其诱导鹅产生的体液免疫抗体水平和细胞免疫抗体水平进行了监测，确定了该疫苗的免疫原性和最佳免疫剂量。进而将该疫苗免疫开产前种鹅，对免疫种鹅的血清抗体水平、免疫种鹅的后代卵黄抗体消长规律及后代雏鹅的攻毒免疫保护力进行监控，为研制高效NGVEV灭活疫苗提供科学依据，为防治雏鹅新型病毒性肠炎的提供了新的手段。
　　 本研究获得以下系列结果：
　　 1.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚宿主细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：在不同时间剖杀的和死亡的鸭胚的尿囊膜、心、肝、肠、脑及肌胃中均发现NGVEV粒子，其直径以70nm-80nm为主，以散在的形式分布，多见于细胞核内。NGVEV粒子通过与细胞膜的特异性吸附而进入宿主细胞，装配成熟的病毒粒子通过细胞核膜及细胞膜破裂的方式被释放。被NGVEV感染宿主细胞的超微结构病变以细胞核膜严重的扩张，内质网的肿胀，线粒体嵴断裂溶解成空泡样为主，其中尿囊膜上皮细胞中线粒体的凝集、固缩变化是该病毒引起的特征性超微病变。
　　 2.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株对体外培养的鸭胚成纤维细胞的适应及其增殖规律：将NGVEV鸭胚尿囊液感染DEF细胞并经连续传代获得了适应DEF细胞生长的NGVEV-CN细胞毒。细胞病变一般出现于感染后72h，到120h细胞病变达80％。NGVEV在DEF上的病毒滴度(TCIDso)随传代次数增加而逐渐增加，直到第5代后维持在较高的水平。病毒滴度随感染时间变化表现为：感染初期首先呈现一个下降过程，4h后毒价开始迅速上升，于96h-144h病毒滴度达到并维持最高水平。NGVEV感染DEF细胞后96h-120h是收获该NGVEV细胞毒的最适时间。
　　 3.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：NGVEV在DEF细胞中呈圆形，无囊膜，直径为75nm-90nm。病毒粒子多散在于细胞核内和集中分布于胞浆空泡内。NGVEV粒子通过吸附于DEF细胞膜表面而进入细胞，成熟的病毒粒子经由细胞核膜的破裂而进入胞浆，再通过出芽、细胞膜破裂及细胞空泡破裂的方式被释放出细胞。被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构病变主要表现为：线粒体的固缩及聚集变化，粗面内质网扩张，胞浆出现空泡或空池样结构，及细胞凋亡现象。伴随着病毒的复制、装配和成熟，细胞中还出现大量的不规则形状的高电子致密物及三种不同特点的胞浆包涵体结构。
　　 4.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致体外培养的鸭胚成纤维细胞凋亡：光学显微镜及电子显微镜观察到NGVEV可诱导DEF细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化；经琼脂糖凝胶电泳检测到感染细胞核酸降解为不同倍数的180bp-200bp的典型梯状条带；用AnnexinV-FITC/PI双标记感染DEF细胞经流式细胞仪检测发现凋亡细胞的比率从感染后48h随感染时间延伸而明显增加，于120h达到凋亡峰，而AnnexinV-FITC/PI双标记的感染DEF细胞经荧光显微镜可观察阳性荧光信号的凋亡细胞。
　　 5.雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、超微形态观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的钡备：通过对NGVEV纯化方法的比较研究，确定以结合差速离心、氯仿处理、氯化铯不连续梯度和等密度梯度超速离心的方法来纯化NGVEV。通过该方法不仅可获得较纯净、多量的NGVEV粒子，还可区分完整的NGVEV粒子和不完整的病毒粒子。经负染电镜观察发现完整的NGVEV粒子具有腺病毒典型形态特征：圆形，无囊膜，直径75nm-90nm，核心、核衣壳及壳粒清晰可见。最后，以纯化的病毒为免疫原成功制备了兔抗NGVEV的高免血清，并通过辛酸-硫酸铵粗提及HighO阴离子交换柱纯化兔抗NGVEV的血清IgG。
　　 6.建立并应用间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光抗体法检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒在人工感染雏鹅组织的定位和侵染规律：以纯化的兔抗NGVEV的血清IgG为一抗，分别建立检测石蜡切片NGVEV的间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光双染法，并应用该方法研究NGVEV-CN强毒株在人工感染雏鹅组织中病毒定殖及动态侵染规律。结果表明：NGVEV抗原主要侵染免疫器官（法氏囊，胸腺，哈德氏腺及脾）和胃肠道器官（腺胃，肌胃及肠道），推测这些器官是NGVEV进入机体后首先侵染靶部位并增殖子代病毒，之后子代病毒通过血液、淋巴液或组织液而释放到其他实质性组织，使得机体在感染后期呈现NGVEV广泛性侵染（除呼吸器官）。被NGVEV侵染的细胞数量随感染时间延长而增加，直到感染后15d。NGVEV侵染的细胞主要包括：各种淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、粘膜细胞、腺细胞等等。
　　 7.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究：通过光学显微镜及电子显微镜对人工感染雏鹅各个组织的宿主细胞观察发现，最先于NGVEV感染3d时在法氏囊中观察到呈凋亡变化的淋巴细胞，之后凋亡细胞广泛出现于免疫器官（法氏囊，胸腺及哈德氏腺）和消化器官（腺胃，肌胃，肠道及肝），而气管和肺极少出现细胞凋亡变化。进一步用琼脂糖凝胶电泳和原位末端标记方法（TUNEL）对NGVEV感染宿主细胞核酸的降解情况进行了检测，发现被感染鹅的免疫器官和胃肠道均出现典型的不同倍数的180bp-200bp的梯状条带，在经TUNEL染色的组织切片中观察到了棕色阳性信号的凋亡细胞。凋亡细胞的数量随感染时间延长而增多，于9d-12d达到最大值。
　　 8.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GoIL-2对疫苗的佐剂效应研究：不同剂量的NGVEV灭活疫苗均能显著提高免疫青年鹅的细胞免疫和体液免疫抗体水平，且抗体水平与免疫剂量有一定关系，NGVEV灭活疫苗以o.5ml/只为最佳免疫剂量。单独使用GoIL-2可提高机体的细胞免疫水平，但是不能使机体产生特异性抗NGVEV抗体。添加不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗能极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)提高被免疫鹅细胞免疫和体液水平，且抗体水平与GoIL-2剂量有一定关系，以1000U/只为最佳剂量。研究表明，免疫后第28d青年鹅的血清抗NGVEV的IgG水平、中和抗体水平及细胞免疫水平达到最高，且在免疫后第175d都维持在一个较高的水平。
　　 9.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对开产前种鹅的免疫效果评价：NGVEV灭活疫苗与添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫后5-6个月内对免疫种鹅所产后代产生确实的保护效果，其中以添加GoIL-2的灭活疫苗免疫种鹅所孵出的后代雏鹅的攻毒100％免疫保护效果更持久。另外，被免疫母鹅血清抗体水平、其所产蛋的卵黄抗体水平与后代雏鹅攻毒免疫保护效果呈现正相关性，因此建议通过对免疫鹅的卵黄抗体的监测来代替血清抗体的监测来对疫苗免疫效果的进行长期监控。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

本论文的创新性工作

缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 禽腺病毒的研究进展

1 腺病毒的概况

2 禽腺病毒的概况

3 雏鹅新型病毒性肠炎的研究概况

第二章 腺病毒感染与宿主细胞凋亡研究进展

1 细胞凋亡概况

2 病毒感染与细胞凋亡关系

3 腺病毒诱导细胞凋亡的发现

4 腺病毒感染与细胞凋亡的作用机制

5 结语

第二部分 实验研究

第三章 NGVEV-CN强毒在感染鸭胚体内的形态发生学以及宿主细胞超微病理学研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株适应鸭胚成纤维细胞及其体外培养的增殖特性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第五章 NGVEV-CN强毒株在鸭胚成纤维细胞上的形态发生学和宿主细胞超微结构病变研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第六章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致鸭胚成纤维细胞凋亡的相关研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第七章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、负染超微结构观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第八章 利用免疫组化SP法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第九章 利用免疫荧光抗体法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第十章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第十一章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GOIL-2对疫苗的佐剂效应研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第十二章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗在开产前种鹅的免疫效果评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三部分 结论

第四部分 参考文献

致谢

作者简介