南江黄羊IGFBP-1和IGFBP-5基因CDS区克隆与组织表达

摘要

IGFBPs在体内循环系统中能与IGFs结合，调控IGFs的半衰期，提高IGFs的生理活性。肝脏和局部组织分泌的IGFBPs共同调控各个组织的生长与发育，从而促进动物机体的生长。本研究以培育品种南江黄羊为试验材料，应用RT-PCR和克隆技术从南江黄羊生后0d的肝脏组织总RNA中克隆出南江黄羊IGFBPs基因家族中的IGFBP-1和IGFBP-5两个基因的全编码区序列。采用SYBR-greenI定量PCR技术研究了南江黄羊在生后0d、15d、30d、60d、90d、120d等6个时间点IGFBP-1基因和IGFBP-5基因性别之间表达差异、组织表达差异和同一组织在不同时间点的发育性变化。结果表明：
　　 (1)克隆得到南江黄羊IGFBP-1和IGFBP-5基因的CDS全序列，长度分别为792bp和816bp，分别编码263和272个氨基酸。山羊IGFBP-1基因的核苷酸、氨基酸序列和绵羊的一致性分别为99％和98％，与其他物种间的一致性也较高。山羊IGFBP-5与绵羊的一致性分别为98％和99％，与其他物种的一致性在80％以上。
　　 (2)生物信息学分析表明IGFBP-1基因的氨基酸序列整个序列中具有明显的疏水性区域，而IGFBP-5基因的氨基酸序列中具有明显的亲水性区域。在IGFBP-1和IGFBP-5中都具有2个跨膜区，并且都具有信号肽。翻译后修饰主要为磷酸化和糖基化，二级结构以无规卷曲为主，其次为α-螺旋，B-折叠最少。进化树分析表明，IGFBP-1与IGFBP-5蛋白氨基酸序列与哺乳动物的同源性较高。
　　 (3)在各个时间点的各个组织中都检测到IGFBP-I和IGFBP-5基因的表达，但相对表达量存在一定的差异。IGFBP-1和IGFBP-5主要产生于肝脏组织，它们在肝脏组织的基因表达量远远高于心脏、脾脏、肺脏和肌肉等组织的表达量(0.01＜P＜0.05或P＜0.01)，在肌肉组织中的表达量最低。
　　 (4) IGFBP-1和IGFBP-5基因在南江黄羊在肌肉组织中都有表达的优势时间点，两个基因在肌肉中的表达规律都表现先上调后下降的趋势。其中，肌肉组织中IGFBP-1基因表达量在生后60d达到最大值。在背最长肌和半膜肌中，IGFBP-5基因的表达量在生后90d时达到最大值，而在臂三头肌和臀股二头肌中在生后60d时达到最大值。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

常用词语缩写

1 文献综述

1.1 IGFBPs的研究进展

1.1.1 IGFBPs的概况

1.1.2 IGFBPs的结构和功能

1.1.3 IGFBPs的生物学功能

1.2 IGFBP-1研究进展

1.2.1 IGFBP-1基因的结构

1.2.2 IGFBP-1的生物学功能

1.3 IGFBP-5研究进展

1.3.1 IGFBP-5基因的结构和表达

1.3.2 IGFBP-5的生物学功能

1.4 本研究的目的和意义

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 仪器与试剂

2.2 试验方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 总RNA质量检测

2.2.3 引物设计

2.2.4 cDNA第一条链合成

2.2.5 RT-PCR扩增

2.2.6 PCR产物的胶回收

2.2.7 RT-PCR产物克隆

2.2.8 IGFBP-1和IGFBP-5基因表达检测

3 试验结果与分析

3.1 IGFBP-1和IGFBP-5基因的克隆

3.1.1 RNA质量

3.1.2 重组质粒的构建

3.1.3 重组质粒的鉴定

3.1.4 目的片段的测序结果

3.1.5 IGFBP-1和IGFBP-5基因生物信息学分析

3.2 IGFBP-1和IGFBP-5基因的表达

3.2.1 荧光定量引物验证

3.2.2 Rea1-time PCR标准曲线的建立

3.2.3 荧光定PCR扩增产物的特异性

3.2.4 IGFBP-1和IGFBP-5基因的性别表达差异

3.2.5 IGFBP-1和IGFBP-5基因的组织表达差异

3.2.6 IGFBP-1和IGFBP-5基因的发育性变化

4 讨论

4.1 IGFBP-1和IGFBP-5基因的序列分析

4.1.1 克隆DNA序列的分析

4.1.2 系统发育分析

4.1.3 IGFBP-1和IGFBP-5蛋白功能分析

4.1.4 IGFBP-1和IGFBP-5蛋白翻译后修饰

4.2 IGFBP-1和IGFBP-5基因的表达

4.2.1 实时定量内参的选用

4.2.2 IGFBP-1基因相对定量

4.2.3 IGFBP-5基因相对定量

5 结论

参考文献

致谢