普通牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的克隆、表达及其对肉质性状的遗传效应分析

摘要

转录因子FoxO是Fox家族的重要成员，包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO64个成员，主要通过PI3K/AKT通路来调节其转录活性。在人和小鼠中，FoxO基因调控成肌细胞和脂肪细胞的增殖与分化，参与骨骼肌的代谢，促进肌肉萎缩。因此，FoxO转录因子对于肌肉和脂肪的形成具有重要作用。
　　 本研究运用RT-PCR结合克隆测序方法分别获得牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的2424bp、1867bp、2211bp的cDNA序列，CDS分别编码了不同的氨基酸数目。氨基酸相似性分析显示：牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的氨基酸序列与猪的相似性最高(93％、98％、93％)，其次是人(93％、96％、87％)、小鼠(90％、94％、84％)。生物信息学分析表明，FoxO1、FoxO3、FoxO4蛋白质分子理化性质相近，均为不稳定的酸性蛋白质，存在磷酸化位点、N-糖基化位点和O-糖基化位点，无跨膜结构。二级结构主要由α螺旋、延伸链、无规卷曲组成。保守结构域预测发现，三种蛋白质均存在95个氨基酸残基组成的Forkhead域，还存在核定位信号和核输出信号，FoxO1、FoxO3、FoxO4蛋白定位在核内的可能性为94.1％。
　　 运用荧光定量PCR技术研究了FoxO1、FoxO3和FoxO4基因在西杂牛6月龄、12月龄、24月龄、36月龄心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮下脂肪、腹脂、背最长肌、半腱肌、腓肠肌、比目鱼肌中的表达情况，结果在10种组织中均检测到FoxO1、FoxO3和FoxO4基因的表达。FoxO1基因在肌肉组织中表达量最高，其次是在皮下脂肪、腹脂、心脏、肾脏中的表达，而在脾脏和肝脏中的表达量较低。FoxO3基因在肌肉组织中的表达量较其它组织高，其次是心脏和肾脏，而在肝脏、脾脏、皮下脂肪、腹脂中的表达量较低；FoxO4基因在肌肉组织中的表达量最为丰富。FoxO1、FoxO3和FoxO4基因在西杂牛不同组织中的发育表达模式存在差异，各个组织有表达的优势时间点。
　　 基因表达量与性状相关性分析表明：FoxO1基因与肌纤维面积呈显著负相关；FoxO3基因表达量与肌纤维密度、肌纤维面积、肌纤维直径显著相关；FoxO4基因表达量与肌纤维直径和肌纤维面积呈显著负相关。
　　 以川南山地黄牛、秦杂牛、西杂牛为试验材料，应用测序技术研究了FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的多态性，结果在FoxO1基因中检测到8个多态位点，均位于第三外显子区域，具体为nt250370(SNP1)由C-→T、nt250433(SNP2)由T→C、nt250463(SNP3)由A→G、nt250499(SNP4)由G→A、nt250544(SNP5)由C→A、nt250661(SNP6)由T→C、nt250920(SNP7)由C→T、nt251031(SNP8)由G→A。8个SNP位点构成了9种单倍型，H1(CCAACTCG)和H3(CCAACTCA)单倍型占优势，9种单倍型共构成了15种单倍型组合。FoxO1基因单倍型组合对肉质性状遗传效应分析表明：FoxO1基因单倍型组合对剪切力、肌纤维直径和肌纤维密度的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，单倍型组合H3H4具有最低的剪切力、肌纤维直径和最高的肌纤维密度，对牛肉肉质具有正效应。
　　 在FoxO3基因中检测到8个多态位点，均位于第二外显子区域，分别为nt190010(SNP1)C→T突变，nt189659(SNP2)C→T突变，nt189656(SNP3)C→T突变，nt189584(SNP4)G→A突变，nt189476(SNP5)C→A，nt189302(SNP6)A→G突变，nt189233(SNP7)C→T突变，nt188968(SNP8)G→C突变。8个SNP位点构成了12种单倍型，H1(CCCGCACG)单倍型频率最高，占71.25％，由12种单倍型构成了13种单倍型组合。FoxO3基因单倍型对三个肉牛群体的肉质性状遗传效应分析表明：FoxO3基因单倍型组合对肌内脂肪含量、肌纤维直径和肌纤维密度的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，单倍型组合H1H6具有最低的剪切力，最高的肌纤维密度和最小的肌纤维直径，该单倍型组合对牛肉嫩度具有正效应。
　　 在FoxO4基因中仅检测到1个多态位点，位于第二外显子区域，具体为nt454949发生G→A突变，整个群体存在2种单倍型，H1(G)单倍型频率远高于H2(A)。FoxO4基因单倍型对三个肉牛群体的肉质性状遗传效应分析表明：单倍型组合对肌纤维直径和肌纤维密度的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，H2H2具有较低的肌纤维直径和较高的肌纤维密度，该单倍型组合对肉质性状具有正效应。

目录

文摘

英文文摘

缩写词对照表

第一章 文献综述

1 转录因子FoxO家族研究进展

1.1 FoxO蛋白的命名

1.2 转录因子FoxO的结构特点及染色体定位

1.3 FoxO转录活性的调节

1.4 FoxO转录因子在各种组织中的生物学功能

1.5 FoxO转录因子在家畜中的研究概况

2 荧光定量PCR及其应用

2.1 荧光定量PCR的原理

2.2 荧光定量PCR的分类及特点

2.3 荧光定量PCR的应用

3 SNP及其在家畜遗传育种中的应用

3.1 SNP的概念与特点

3.2 SNP检测方法

3.3 SNP在家畜遗传育种中的应用

4 本研究的目的和意义

第二章 牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的克隆与生物信息学分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 总RNA抽提结果

3.2 cDNA扩增

3.3 目的片段的测序结果

3.4 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因序列分析

3.5 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的生物信息学分析

4 讨论

4.1 电子克隆

4.2 RNA质量和反转录

4.3 牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的序列分析

4.4 牛FoxO蛋白的生物信息学分析

5 结论

第三章 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因在西杂牛中的表达谱分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 总RNA抽提结果

3.2 常规PCR检测

3.3 荧光定量PCR扩增

3.4 目的基因和内参基因的标准曲线

3.5 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因在不同月龄时的组织表达差异

3.6 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因在不同发育阶段的表达差异

3.7 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表达量与肉质性状关联分析

4 讨论

4.1 内参基因的选择

4.2 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的组织表达分析

4.3 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因在不同发育阶段的表达差异

4.4 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表达量与牛肉肉质性状相关分析

5 结论

第四章 牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 不同肉牛群体的肉质性状分析

3.2 FoxO1基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

3.3 FoxO3基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

3.4 FoxO4基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

4 讨论

4.1 关于牛肉肉质

4.2 牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因多态位点及单倍型分析

4.3 FoxO1、FoxO3、FoxO4基因多态性与肉质性状的关联分析

5 结论

第五章 总结

1 论文结论

2 创新点

3 进一步的研究工作

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的论文、参编专著情况