松材线虫低温冷冻保存的研究

摘要

松材线虫的低温冷冻保存能够充分利用并收集各种来源的松材线虫，可为松材线虫的致病机理和生物防治技术的研究和应用提供大量实验材料，并且不受时间和空间的限制。目前，国内还没有关于松材线虫低温冷冻保存的成功报道，国外关于这方面的报道也很少，尚缺乏系统的研究。本试验研究了松材线虫冷冻保存过程中冷冻方法、冷冻保护剂种类和浓度、预处理时间、解冻方式以及冷冻时间对冷冻保存效果的影响，结果如下：
　　 1.为了筛选玻璃化冷冻保护剂，将EG、GL和、DMSO三种冷冻保护剂和无菌水按照不同比例配制成6种玻璃化保护液，比较不同玻璃化保护液对线虫的毒性作用与冷冻效果。试验结果表明，单一的EG或GL的冷冻效果显著优于GL+EG混合液(P＜0.05)，前两者之间的差异不显著(P＞0.05)，单一的EG或GL作为冷冻保护剂效果最好。
　　 2.在上述试验的基础上，以低浓度EG和GL为预处理液，比较不同预处理液浓度对松材线虫冷冻效果的影响，以没有经过预处理的松材线虫作为对照。结果表明，GL作为预处理剂的冷冻效果显著高于EG(P＜0.05);经过5％GL预处理的线虫存活率最高，为36.5％，相比其他试验组的冷冻效果显著较好(P＜0.05)。
　　 3.通过1h、2h、3h、4h和5h的平衡时间对松材线虫进行冷冻，比较比较不同平衡时间对松材线虫冷冻效果的影响，结果表明，平衡2h和3h的线虫冻后存活率最高，分别达到32.1％和32.6％，显著高于1h、4h和5h(P＜0.05)。由此推断，线虫平衡2-3h后进行冷冻，冷冻效果最好。
　　 4.将GL用无菌水分别配置成30％,40％,50％和60％系列浓度溶液，比较不同浓度冷冻保护剂对松材线虫冷冻效果的影响，结果表明，GL浓度为20％、25％时对松材线虫的冷冻效果最好，存活率为35.6％和36.2％，显著高于其它的浓度(P＜0.05)。在上述试验的基础上分别添加不同浓度的蔗糖或海藻糖进行冷冻保存，研究非渗透性保护剂对松材线虫冷冻效果的影响，结果表明，添加同一浓度的海藻糖或蔗糖，冷冻后的线虫存活率差异不显著(P＞0.05)；添加0.25M的蔗糖或海藻糖进行冷冻，与其他试验组相比，冷冻效果显著较好最好(P＜0.05)。
　　 5.以不同的解冻温度20℃，30℃，40℃，50℃和60℃对冷冻24h的线虫分别进行水浴解冻和干热解冻，比较不同解冻方式和解冻温度对松材线虫冷冻效果的影响，结果表明，干解冻的方式明显不能用于线虫的冷冻保存；水浴解冻温度为40℃时，线虫的冻后活率达到42.2％，显著高于其他试验组(P＜0.05);
　　 6.在玻璃化冷冻保存的基础上，设计了7组降温程序，采用程序化冷冻法对松材线虫进行冷冻，筛选最合适的降温程序。结果表明，采用降温程序5（在4℃以1℃/min的速率降温至-6℃，再以20℃/min的速率降温至-40℃，然后以10℃/min的速率升温至-20℃，最后以1℃/min的速率降温至-45℃，迅速投入液氮）的冻后线虫活率达到41.1％,显著高于其他降温程序(P＜0.05)。
　　 7.以低浓度的GL、EG及二者的组合为冷冻保护剂，并添加0.25M的蔗糖进行程序化冷冻保存，筛选最适的程序化冷冻保护剂。试验结果表明，10％-15％GL作为程序化冷冻保护剂的冷冻效果最好，冻后存活率分别为50.9％和49.6％，二者差异不显著(P＞0.05)。
　　 8.分别采用玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对松材线虫进行冷冻保存，比较不同株系线虫的冷冻效果及冷冻后的繁殖情况，结果表明，不同株系间的冷冻效果差异不显著(P＞0.05)；程序化冷冻松材线虫幼虫的冷冻效果最佳，达到了53.6％；冻后繁殖的线虫再冷冻，其冷冻效果与亲代差异不显著(P＞0.05)。
　　 9.采用玻璃化冷冻法，比较了不同冷冻时间对松材线虫冷冻效果的影响，结果表明，线虫的冻后活率没有随着冷冻时间的增长而降低，不同时间段解冻后的线虫存活率之间差异不显著(P＞0.05)。

目录

文摘

英文文摘

前言

1. 文献综述

1.1 低温冷冻保存的原理及其损伤机理

1.1.1 低温冷冻保存的原理

1.1.2 水形成冰晶的过程

1.1.3 冷冻损伤机理的研究

1.2 线虫保存方法的研究进展

1.2.1 冷冻保护剂的作用

1.2.2 低温冷冻保存方法

1.2.3 解冻方法及稀释处理

2 研究目的和意义

3 材料与方法

3.1 技术路线

3.2 试验材料

3.2.1 供试虫株

3.2.2 主要药品

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 主要溶液的配制

3.3 试验方法

3.3.1 线虫悬液混均计数法

3.3.2 线虫的冷冻

3.3.3 线虫的解冻与稀释

3.3.4 线虫的复苏与镜检

3.3.5 冷冻时间对线虫的影响

3.3.6 不同株系线虫的冷冻效果

3.3.7 冻后线虫的繁殖效果

3.4 试验设计

3.4.1 线虫玻璃化冷冻保存研究

3.4.2 线虫程序化冷冻保存研究

3.4.3 不同株系线虫的冷冻效果及冷冻后的繁殖情况

3.4.4 冷冻时间对松材线虫冷冻效果的影响

3.5 统计分析

4 结果与分析

4.1 线虫玻璃化冷冻保存研究

4.1.1 玻璃化冷冻保护剂的筛选

4.1.2 不同预处理方式对松材线虫存活率的影响

4.1.3 不同平衡时间对松材线虫冷冻效果的影响

4.1.4 不同浓度保护剂对松材线虫冷冻效果的影响

4.1.5 非渗透性保护剂对松材线虫冷冻效果的影响

4.1.6 不同解冻方式对松材线虫冷冻效果的影响

4.2 线虫程序化冷冻保存研究

4.2.1 降温程序的筛选

4.2.2 程序化冷冻保护剂的筛选

4.3 不同株系线虫的冷冻效果及冷冻后的繁殖情况

4.4 冷冻时间对松材线虫冷冻效果的影响

5 讨论

5.1 冷冻保护剂对松材线虫保存效果的影响

5.1.1 渗透性保护剂

5.1.2 非渗透性保护剂

5.1.3 保护剂浓度

5.2 预处理方式对松材线虫保存效果的影响

5.3 平衡时间对松材线虫保存效果的影响

5.4 解冻方式对松材线虫冷冻效果的影响

5.5 降温程序的设计筛选

5.6 冷冻方法

5.7 不同株系线虫的冷冻效果及冷冻后的繁殖情况

6 结论

参考文献

附录

附录1 主要缩略词表

附录2 图版说明

致谢