产气荚膜梭菌的基因分型及地衣芽孢杆菌对鸡坏死性肠炎回肠菌群的影响

摘要

试验从不同日龄健康鸡群的嗉囊、十二指肠、胆囊、空肠、回肠和盲肠内容物中分离产气荚膜梭菌，确定其基因型。此外，从健康鸡回肠分离筛选到一株对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性、耐热、耐酸和耐胆盐的芽孢杆菌。最后，将分离的芽孢杆菌用于动物试验，研究其对产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎鸡群生长性能、免疫器官指数、回肠菌群及其多样性的影响。其主要内容包括：
　　 1.产气荚膜梭菌的分离鉴定：采用CW卵黄卡那霉素和紫牛乳培养基，从21、28、35、42、49日龄健康鸡群的组织内容物中分离，其中十二指肠、胆囊、空肠、回肠内容物未分离到产气荚膜梭菌，嗉囊和盲肠的内容物分离得到27株产气荚膜梭菌，检出率为9.0％。
　　 2.产气荚膜梭菌的基因型：分离的27株产气荚膜梭菌经Multi-PCR都只扩增出a条带，毒素基因分型结果均为A型。REP-PCR和ERIC-PCR两种分型方法均表明不同日龄、不同组织来源的产气荚膜梭菌亚型差异明显，而同一日龄、相同组织的亚型较单一，交叉有少数其他亚型。
　　 3.芽孢杆菌的筛选：从健康鸡空肠、回肠、盲肠内容物中分离到5株芽孢杆菌(K1,H1,H2,M1,M2)，经筛选得到耐受性较好的H2，其分子生物学鉴定为地衣芽孢杆菌。通过代谢产物抗病原微生物的生物学性能试验，发现H2具有很好的抑菌性能，其体外抑菌成分主要是酸性依赖物质。
　　 4.动物试验：购买健康1日龄铁脚麻135羽，随机分成9组。1组是空白对照，不进行感染。2到9组均在15日龄时每只鸡灌喂1mL球虫卵囊(100万个/ml),17-20日龄每天灌喂产气荚膜梭菌1mL CVCC2030(1.0×108CFU/mL)，建立感染模型。3、4、5为预防组，分别在基础日粮中添加0.05％、0.1％、0.2％菌粉Ⅰ(含芽孢杆菌H2活菌数1.0×109CFU/g)。6、7、8为治疗组，在0-21日龄饲喂基础日粮中添加0.05％的菌粉Ⅰ,21日龄后分别在基础日粮中添加0.1％、0.2％、0.4％菌粉Ⅱ(含芽孢杆菌H2活菌数1.0×1010CFU/g),9组在基础日粮中添加0.1％盐霉素作为治疗对照组。
　　 (1)生长性能：28日龄时添加芽孢杆菌预防、治疗感染鸡模型和空白组的末期体重、平均日增重均比感染组高，差异极显著(P＜0.01)；料重比比感染组低，差异极显著(P＜0.01）。其中4、8组效果最明显。
　　 (2)免疫器官指数：28日龄时3、4、5组法氏囊指数、胸腺指数、脾脏指数与感染组的差异极显著（P＜0.01），4组脾脏指数与3、5组的差异显著（P＜0.05），说明添加0.1％菌粉Ⅰ在基础日粮中对提高肉鸡免疫器官指数有效。6、7、8组胸腺指数、脾脏指数与感染组的差异极显著（P＜0.01），法氏囊指数与感染组的差异显著(P＜0.05)。9组法氏囊指数、胸腺指数、脾脏指数与感染组的差异极显著(P＜0.01),与空白组的差异不显著（P＞0.05）。
　　 (3)回肠菌群：28日龄时，3、4、5组产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌数量显著下降(P＜0.05)，乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌数量显著升高(P＜0.05)。6、7、8组乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌数量显著升高（P＜0.05），产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌数量极显著下降(P＜0.01)。9组各种菌数与感染组的差异不显著(P＞0.05)，结果表明，芽孢杆菌预防和治疗组都使回肠健康指数B/E值升高。
　　 (4)PCR-DGGE技术分析回肠菌群结构及多样性：28日龄时，空白组、饲喂芽孢杆菌预防、治疗各组与感染组的图谱条带差显极著异(P＜0.01），感染组条带数仅为19，表明肠道内菌群多态性降低。空白组条带数是26.3,3、4、5组条带数分别是23.7、31、30.3，说明饲喂芽孢杆菌能够保护肠道微生物群，提高鸡肠道微生物多态性，4组效果最好。6、7、8、9组条带数分别是23.6、25.3、33.7、21，说明在饲喂芽孢杆菌预防的基础上，再添加高剂量的芽孢杆菌治疗也能够保护肠道微生物群的多态性，8组效果最好。
　　 (5)回肠形态检测：空白组、预防组、治疗组和感染组回肠绒毛高度差异极显著（尸＜0.01）；与空白组回肠绒毛高度相比，4组提高了19.52％,8组降低了17.25％,但仍比感染组高。表明在1日龄起添加0.05％以上的菌粉Ⅰ，均具有保护肠组织结构的作用。

目录

文摘

英文文摘

1. 前言

1.1 产气荚膜梭菌简介

1.1.1 产气荚膜梭菌的致病性

1.1.2 产气荚膜梭菌的危害

1.2 产气荚膜梭菌的分型

1.2.1 多重PCR鉴定产气荚膜梭菌毒素

1.2.2 基因组短重复序列标记

1.2.3 产气荚膜梭菌的分型研究进展

1.3 产气荚膜梭菌与禽类致病

1.3.1 禽类坏死性肠炎的临床和亚临床表现

1.3.2 禽类坏死性肠炎的患病因素

1.4 预防控制禽类产气荚膜梭菌的感染

1.4.1 免疫接种

1.4.2 控制球虫病

1.4.3 饲料成分

1.4.4 抗生素促生长剂

1.4.5 竞争性排斥培养物

1.4.6 益生素

1.4.7 益生元

1.5 DGGE指纹图谱技术在动物肠道菌群微生物群落中的应用

1.5.1 DGGE技术原理

1.5.2 DGGE在肠道菌群微生物中的应用

1.6 本研究的目的与意义

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 试验试剂的配制

2.1.5 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 菌株的分离培养

2.2.2 多重PCR(Multi-PCR)鉴定与基因分型

2.2.3 REP-PCR、ERIC-PCR分析

2.2.4 药敏试验

2.2.5 体外筛选拮抗产气荚膜梭菌的芽孢杆菌

2.2.6 动物试验

3. 结果与分析

3.1 菌株的分离培养及鉴定结果

3.1.1 产气荚膜梭菌的分离结果

3.1.2 芽孢杆菌的分离鉴定

3.2 Multi-PCR鉴定与基因分型

3.2.1 Multi-PCR的特异性检测

3.2.2 Multi-PCR样品鉴定结果

3.3 REP-PCR、ERIC-PCR分析

3.3.1 REP-PCR对产气荚膜梭菌分型结果

3.3.2 ERIC-PCR对产气荚膜梭菌分型结果

3.4 耐药性检测结果

3.5 体外初筛拮抗产气荚膜梭菌的芽孢杆菌结果

3.5.1 体外初筛拮抗产气荚膜梭的芽孢杆菌

3.5.2 芽孢杆菌耐酸性试验

3.5.3 芽孢杆菌耐胆盐试验

3.5.4 芽孢杆菌菌液、菌体、代谢产物的拮抗试验

3.5.5 芽孢杆菌代谢产物生物学性能试验

3.6 动物试验结果

3.6.1 芽孢杆菌对感染鸡模型生长性能的影响

3.6.2 芽孢杆菌对感染鸡模型免疫器官指数的影响

3.6.3 芽孢杆菌对感染鸡模型回肠菌群的影响

3.6.4 各处理组回肠微生物群落结构和多样性的差异性

3.6.5 28日龄芽孢杆菌预防、治疗对感染鸡模型回肠绒毛高度测定

4. 讨论

4.1 产气荚膜梭菌的分离鉴定

4.2 Multi-PCR的毒素分型

4.3 REP-PCR和ERIC-PCR对产气荚膜梭菌的亚型分析

4.4 拮抗产气荚膜梭菌芽孢杆菌分离及筛选

4.5 芽孢杆菌对感染鸡模型生长性能的影响

4.6 芽孢杆菌对感染鸡模型免疫器官指数的影响

4.7 芽孢杆菌对感染鸡模型肠道菌群的影响

4.8 各处理组回肠微生物群落结构和多样性的差异性

5. 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录