猪胰腺α-淀粉酶基因的克隆、毕赤酵母表达纯化与酶学特性分析

摘要

a-淀粉酶（a-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1）催化水解淀粉，糖原和麦芽糖的a-D-(1，4)-糖苷键，随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖。该蛋白广泛分布于细菌，古细菌和真核生物中。由于其广谱的淀粉水解活性，不仅在食品工业中具有较高应用价值，而且在医疗、日用化工及饲料等方面也发挥着重要的作用。目前工业途径获得的a-淀粉酶主要是从微生物中提取，但在饲料应用上都存在着成本高和使用安全性等问题。通过生物技术手段，将猪自身的基因克隆到微生物体内，诱导表达生产a-淀粉酶具有产量高、生产工艺简单、生产成本较低等优点，颇有发展前途。
　　 本研究的目的就是试图通过基因工程手段，利用微生物生产-种高效价廉的重组猪的胰腺a-淀粉酶产品。编码PPA基因全长的cDNA序列以RT-PCR法从猪胰腺细胞中克隆并将其连接到表达载体质粒pPICZaA得到重组质粒pPICZaA-PPA，经SacⅠ酶切线性化切开后，通过电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母X-33染色体上，利用含不同浓度Zeocin的YPDS平板对转化子进行抗性筛选。采用实时定量PCR对mRNA表达量高的转化子进行筛选，RNA表达量高的转化子进行BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导，在醇氧化酶1(AOX1)强启动子的作用下，实现了PPA在毕赤酵母中的表达。用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化重组蛋白，目的蛋白经SDS-PAGE检测后确定约为58kDa的重组表达产物，与预期目的蛋白产物大小基本相符。重组蛋白酶学特性测定显示：最适pH和温度分别是：7.5和55℃；米氏常数Km和最大反应速度分别为：48.8mg/ml和1.3mg/min;在50℃恒温水浴30min酶活损失近50％;对金属离子的抑制性试验发现，Cu2+(0.08mMol/l)对重组蛋白的抑制作用明显强于Fe3+(24mMol/l)，Ca2+(15mMol/l)，Zn2+(12mMol/l)。通过对比重组蛋白和胰腺提取蛋白发现，二者是在酶学特性上是十分相似的。说明重组PPA在毕赤酵母中获得了成功的表达。

目录

文摘

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项目基金资助

中英文缩写词表

前言

一 文献综述

1 a-淀粉酶概述

1.1 a-淀粉酶发现

1.2 a-淀粉酶来源

1.3 淀粉酶分类

1.4 a-淀粉酶的主要用途

2 a-淀粉酶的结构特点

2.1 a-淀粉酶的氨基酸组成

2.2 a-淀粉酶的空间结构

2.3 猪的胰腺a-淀粉酶的结构

3 a-淀粉酶性质

3.1 pH对酶活性的影响

3.2 温度对酶活性的影响

3.3 与a-淀粉酶活性的关系的部分离子

3.4 a-淀粉酶与底物的作用的特性

4 a-淀粉酶的催化机制

5 a-淀粉酶研究进展

5.1 酸性a-淀粉酶

5.2 耐碱性a-淀粉酶

5.3 耐高温a-淀粉酶

5.4 低温a-淀粉酶

6 a-淀粉酶基因克隆表达研究进展

6.1 a-淀粉酶基因的克隆

6.2 a-淀粉酶基因表达研究进展

7 选题背景和依据

7.1 a-淀粉酶应用面临的问题

7.2 猪体内的PPA分泌特性

7.3 本实验拟解决的问题

7.4 预期结果及创新性

二 材料与方法

1 材料和仪器

1.1 材料与试剂

1.2 培养基

1.3 主要溶液

1.4 主要仪器设备

1.5 引物设计与合成

2 实验方法

2.1 PPA基因的克隆

2.2 P.pastoris/pPICZaA-PPA表达载体的构建

2.3 重组猪PPA的酵母转化与表达

2.4 a-淀粉酶酶活测定

2.5 a-淀粉酶酶学性质分析

三 实验结果与分析

3.1 PPA编码基因TA克隆

3.1.1 总RNA的提取与PPA编码区RT-PCR扩增

3.1.2 PPA基因TA克隆

3.2 PPA编码基因表达载体构建

3.2.1 含酶切位点PPA基因片段的扩增结果

3.2.2 pPICZaA质粒的双酶切

3.2.3 阳性克隆PCR检测与酶切鉴定

3.3 P.pastoris/p PICZa A-PPA表达菌株的转化与筛选

3.3.1 重组质粒的线性化

3.3.2 PCR检测转化子

3.3.3 Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测

3.4 PPA在P.pastoris中的表达与纯化

3.5 重组酶a-淀粉酶酶学性质分析

3.5.1 pH对a-淀粉酶活性的影响

3.5.2 温度对a-淀粉酶活性的影响

3.5.3 重组酶热稳定性

3.5.4 动力学特性

3.5.5 金属离子对重组蛋白酶活的影响

四 讨论

1 载体构建

1.1 限制性内切酶的筛选

1.2 引物设计

1.3 Taq酶的选择

1.4 RePPA与天然PPA在结构上的差异

2 PPA基因在毕赤酵母中的表达

2.1 表达体系的选择

2.2 重组蛋白的诱导表达

3 酶学特性分析

五 结论与展望

5.1 PPA提高表达产量的研究

5.2 改造PPA的分子结构提高其活性范围

5.3 利用PPA的高表达量来串联融合表达其他蛋白

参考文献

致谢

附录一

附录二

附录三