撑×绿杂交竹梢枯病生物防治的研究

摘要

撑×绿杂交竹梢枯病(Hybrid bamboo blight)是由半知菌亚门丝孢纲节菱孢属的暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum(Corda)M. B.Elli)侵染所引起的一种危害严重的病害，已造成杂交竹大面积枯死。目前，尚缺乏有效的杂交竹梢枯病抗病品种，对它的防治措施主要采用施用化学药剂和营林技术；而无污染、无公害生物防治措施在该病害上尚无人涉及。本文通过对杂交竹枝、叶表面微生物的分离及拮抗菌的筛选，在研究生防菌发酵条件及抗菌物质基础上，运用抗生素标记检测生防菌的定殖规律，探索田间目标生防菌对撑×绿杂交竹梢枯病生物防治效果，为进一步开发出有效的生防制剂奠定基础。获得以下主要研究结果：
　　 1、通过稀释平板法从健康杂交竹枝叶表面和内部分离出168株菌株（真菌57株，细菌88株，放线菌23株），经多次对峙培养筛选出对暗孢节菱孢菌有较好拮抗作用的菌株ZB-27;该抗生菌对病原菌平均抑制率达75.52％，拮抗带平均宽1.807cm;病原菌菌落严重萎缩变形，不再生长，近端菌丝变淡绿色。借助形态学、生理生化特征和16S rDNA分析证实该拮抗菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
　　 2、根据正交试验设计对铜绿假单胞菌ZB-27菌株的发酵条件进行优化，方差分析表明温度，pH值，瓶装量，接种量，C源，N源对ZB-27的拮抗效果的影响极显著，最适培养基组分浓度和培养条件为：牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖1g,(NH4)2SO40.05g,pH值为7.5，接种量1ml且瓶装量50ml培养液于300ml三角瓶中振荡培养，最适温度为25℃；在此发酵参数下，铜绿假单胞菌ZB-27菌株抗菌物质的能力大大提高，抑菌率超过80％,其抗菌活性的变化共分为两个阶段：0～60小时为对数期，抗菌活性显著增加；60小时，该菌的抗菌活性达到最高峰；60小时后进入衰亡期，该菌的抗菌活性急剧下降。生长曲线研究显示，0～12小时为延滞期，菌体生长缓慢；12～42小时为对数期，菌体生长迅速：42～90小时为稳定期，菌体基本没有生长，维持在某一个水平；90小时以后便进入了衰退期。
　　 3、利用有机溶剂萃取、硫酸铵沉淀获得了菌株ZB-27的代谢粗提物，并测定了沉淀和上清液的抑菌活性，结果表明，上清液基本没有活性，而沉淀物有-定活性，可推断其产生的活性成份为蛋白质类物质。代谢粗提物的稳定性试验显示，抗菌物质具有耐热、耐酸碱、耐紫外线、对蛋白酶不敏感等特点。
　　 4、运用抗生素标记，成功获得抗氯霉素750μg/ml的ZB-27突变菌株。研究结果表明，标记菌株具有稳定抗药性，且与原始菌株具有同等的平板抑制作用和防治效果。喷施菌悬液后，标记菌株ZB-27可以很快定殖到杂交竹枝叶，并在相当长时期内维持稳定的定殖量。从定殖数量上看，高浓度(109、107cfu/ml)的初始菌液定殖数量大于低浓度的菌液；尤其在叶部上定殖数量最高，存活期最长，8天时达到最大，到40天时仍能保持在较高的水平(4.397×104、2.279×104cfu/g)。从病原菌对生防菌定殖影响上看，病原菌的接入对生防菌在叶部的定殖影响较大，而对在枝干定殖影响较小。
　　 5、田间生物防治试验显示，病菌对照发病率极高，空白对照均未发病，不管是利用菌悬液还是用其产生的次生代谢物防治杂交竹梢枯病都有较好的防治效果，其中，预先接种菌悬液和代谢产物的处理最好，防效分别为70.07％、68.05％，显著高于其他处理。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 植物病害生物防治的研究进展

1.1 生物防治概述

1.2 生防微生物的种类及其研究进展

2 拮抗细菌在生物防治中的应用

2.1 生防细菌的种类

2.2 生防细菌的作用机制

2.3 生防细菌的定殖研究

2.4 铜绿假单胞菌的研究进展

3 竹梢枯病研究进展

3.1 分布与危害

3.2 病原及症状

3.3 发生规律及流行条件

3.4 竹枯梢病的防治

4 研究的目的与内容

4.1 主要研究内容

4.2 技术路线

第二章 杂交竹梢枯病生防茵的分离与筛选

1 主要材料

1.1 供试菌株

1.2 培养基

1.3 主要仪器

2 试验方法

2.1 样地的选择和样品的采集

2.2 微生物的分离

2.3 拮抗菌的筛选

2.4 拮抗菌的鉴定

3 结果与分析

3.1 微生物分离结果

3.2 杂交竹梢枯病生防菌的筛选

3.3 生防菌的鉴定

4 结论与讨论

第三章 生防菌发酵条件优化及抗菌物质的研究

1 主要材料

1.1 供试菌株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 试验方法

2.1 生防菌的最优培养条件筛选

2.2 铜绿假单胞菌生长量与代谢产物拮抗活性的关系

2.3 抗菌物质的测定

3 结果与分析

3.1 生防菌培养条件优化

3.2 铜绿假单胞菌ZB-27生长曲线的测定

3.3 培养时间与代谢产物拮抗活性的关系

3.4 抗菌物质的性质测定

4 结论与讨论

第四章 生防茵的定殖能力及对杂交竹梢枯病防控作用研究

1 主要材料

1.1 供试植株

1.2 供试菌种

1.3 主要仪器

1.4 抗生素种类

2 试验方法

2.1 病原菌接种体的制备

2.2 生防菌制剂的制备

2.3 杂交竹枝、叶的处理

2.4 供试菌株天然抗药性检测

2.5 生防菌抗生素突变体的筛选

2.6 标记菌株与未标记菌株的比较

2.7 标记性状的稳定性检测

2.8 标记菌株在杂交竹枝叶上的定殖检测

2.9 生防菌对杂交竹梢枯病的田间防治试验

3 结果与分析

3.1 生防菌抗生素种类及突变体的筛选

3.2 标记菌株与未标记菌株的比较

3.3 标记性状的稳定性检测

3.4 标记菌株在杂交竹枝叶上的定殖动态

3.5 生防菌对杂交竹梢枯病的田间防治效果

4 结论与讨论

小结与展望

1 小结

2 展望

参考文献

致谢