黄芪多糖作为佐剂对乙型肝炎疫苗免疫反应影响的研究

摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的一种影响人类健康的世界性传染病。接种乙肝疫苗是目前控制乙型肝炎感染的最有效的措施，但是传统的乙型肝炎亚单位疫苗是由乙型肝炎病毒的表面抗原和铝佐剂组成，铝佐剂疫苗仅能引起很好的体液免疫反应而不能引起有效的细胞免疫反应。
　　 佐剂可以增强细胞免疫和体液免疫，活化T细胞，上调细胞因子的表达，增强免疫记忆，并能改变免疫反应类型。因此改良佐剂可能增强传统乙型肝炎亚单位疫苗的免疫反应。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides， APS)是中药黄芪的提取物，具有广泛的药理作用，也具有很强的免疫调节作用。APS可从多个方面发挥免疫调节作用：直接影响免疫细胞内的物质代谢，诱导产生相关的免疫调节因子；不仅能够增强机体的特异性免疫反应，还可以增强非特异性免疫反应；既前增强正常机体的免疫功能，又可调节异常机体的免疫功能。
　　 本研究将APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂与疫苗一起免疫昆明白小鼠，研究其对乙肝疫苗免疫反应的影响，尤其是对细胞免疫反应的影响。实验选取健康雌性6～8周龄昆明白小鼠35只，体重20～24g，随机分为5组，每组7只，分别为rHBsAg组、rHBsAg+APS组、rHBsAg+aulm组、APS组和对照组（不进行免疫）。初次免疫设为0天，第14天加强免疫一次，在第21天进行免疫学指标的检测。主要结果如下：
　　 实验使用定量ELISA法检测IgG水平，用MTT法检测T细胞增殖反应，用流式细胞仪检测体内CTL反应，结果发现APS显著增强乙肝疫苗诱导产生较高的IgG抗体水平，较强的T淋巴细胞增殖反应和体内CTL杀伤反应，表明APS能够增强乙肝疫苗的免疫反应。
　　 为进一步研究APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂对免疫反应的影响，对有关免疫学指标作了进一步检测。用RT-PCR法检测PFP、GraB、FasL和Fas的表达以及用流式细胞仪检测体内细胞因子的表达水平，结果表明APS能够增强乙肝疫苗上调PFP、GraB、FasL、Fas和CD8+T细胞IFN-γ的表达水平，与体内CTL反应结果一致；APS能够增强乙肝疫苗诱导较高的CD4+T细胞IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平，表明APS作为乙肝疫苗的佐剂能够促进机体Th1型和Th2型免疫反应。
　　 为进一步探讨APS作为佐剂增强免疫反应的作用机理，用半定量PT-PCR法对TLR2、TLR4、TGF-β1和Foxp3的表达水平进行检测，结果表明APS能够很好地增强乙肝疫苗诱导TLR2和TLR4表达，通过上调TLR2和TLR4的表达激发协同刺激分子和相关细胞因子的表达参与适应性免疫应答；APS作为乙肝疫苗的佐剂能够明显降低机体TGF-β1和Foxp3表达水平，通过抑制TGF-β1和Foxp3的表达促进机体免疫反应。
　　 以上结果表明，APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂能增强乙肝疫苗的免疫反应。本研究初步证实了APS是一种良好的免疫佐剂，能够显著地提高乙型肝炎亚单位疫苗的体液免疫水平和细胞免疫水平，为乙型肝炎疫苗的研发提供了有意义的基础研究数据资料。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 文献综述

1.1 乙型肝炎概述

1.1.1 乙型肝炎简介

1.1.2 乙型肝炎病毒

1.1.3 乙型肝炎疫苗

1.2 黄芪多糖的免疫调节作用研究进展

1.2.1 中药黄芪

1.2.2 黄芪多糖

1.2.3 黄芪多糖对非特异性免疫的促进作用

1.2.4 黄芪多糖对特异性免疫的促进作用

1.2.5 黄芪多糖对凋亡因子的影响

1.2.6 黄芪多糖抗肿瘤作用及机制

1.2.7 黄芪多糖的抗病毒作用及应用

1.3 免疫佐剂

1.3.1 铝佐剂

1.3.2 弗氏佐剂

1.3.3 细胞因子

1.3.4 CpG

1.3.5 脂质体

1.3.6 中药多糖

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 主要试剂

2.1.1 动物免疫试剂和抗原

2.1.2 ELISA主要试剂

2.1.3 T细胞增殖所用试剂

2.1.4 RT-PCR所用试剂

2.1.5 琼脂糖凝胶电泳所用溶液

2.1.6 细胞因子及表面分子染色主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 实验动物及免疫

2.3.2 血样收集

2.3.3 定量ELISA检测1gG含量

2.3.4 T细胞增殖实验

2.3.5 细胞因子胞内染色

2.3.6 RT-PCR检测细胞因子

2.3.7 体内CTL反应

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 抗体水平

3.2 T细胞增殖反应

3.3 APS对CD4+T细胞IFN-Γ表达的影响

3.4 APS对CD4+T细胞IL-2表达的影响

3.5 APS对CD4+T细胞IL-4表达的影响

3.6 APS对体内CTL的影响

3.7 APS对CD8+T细胞IFN-Γ表达的影响

3.8 APS对细胞凋亡因子及相关蛋白表达的影响

3.9 APS对TLR2和TLR4表达的影响

3.10 APS对TGF-B的影响

3.11 APS对FOXP3的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢