马卡小麦种子蛋白及基因研究

摘要

种质资源是作物新品种选育的物质基础，将近缘属种优异基因资源转入普通小麦一直受到育种工作者关注。马卡小麦作为小麦族的种质资源之一，收集并研究其各方面品质特性对我国小麦的品质改良有着一定的应用价值。马卡小麦含有优质面包等位基因，与普通小麦杂交能正常结实并产生生育能力正常的杂种后代，转移基因容易。本文对来自格鲁吉亚、匈牙利、前苏联、英国、美国、瑞士和瑞典等国家的29份马卡小麦醇溶蛋白和高分子量谷蛋白的遗传变异进行检测，以期为进一步发掘和利用马卡小麦特异基因资源提供理论依据。并根据醇溶蛋白和LMW-Glutenin基因的N-端和C-端保守区设计特异性引物，采用PCR克隆的方法，对2份马卡小麦的醇溶蛋白基因和LMW-GS进行深入分析，既了解马卡小麦基因序列特征特性，同时也可发掘其中的优异新基因，以期为小麦品质改良提供理论依据和物质基础。
　　 抗病基因的研究一直是小麦抗病虫害研究的热点，目前己有多个抗病基因从其它小麦转入普通小麦中。但关于马卡小麦抗虫基因的研究和利用目前国内外尚未见报道，将α-淀粉酶抑制因子用于植物转基因抗虫，安全性好，更易于人们接受。本研究的目的就是对马卡小麦α-淀粉酶抑制因子CM16基因进行分离克隆与序列分析，为筛选优异抗虫基因提供基础。本研究主要内容如下：
　　 一、种子贮藏蛋白A-PAGE和SDS-PAGE分析马卡小麦是六倍体(2n=6x=42,AABBDD)栽培小麦，与普通小麦杂交能正常结实并产生有生育能力的杂种后代，确属普通小麦遗传改良的重要基因资源。本文对不同地理来源的马卡小麦种子贮藏蛋白进行了检测与分析，主要结果如下:采用APAGE法检测到马卡小麦29份供试材料醇溶蛋白位点变异丰富。共有28种带型和49条谱带，每份材料可电泳分离出19-34条带，平均25条。材料间遗传相似系数变异范围为0.29-0.95，平均值为0.61，表明马卡小麦具有较丰富的遗传多样性。在0.58水平上明显聚为3类，聚类结果与材料来源地没有必然联系。同时推测来自格鲁吉亚的材料在醇溶蛋白等位变异上可能存在两种主要类型。
　　 利用SDS-PAGE法分析马卡小麦高分子谷蛋白亚基(HMW-GS)组成，结果发现其HMW-GS存在较丰富的亚基变异，共检测到9种亚基类型和9种亚基组合.其中，GluA1位点上null亚基出现频率最高(达82.8％)。Glu-B1位点上7+8为优势亚基(占53.3％),7+9亚基出现频率也相对较高(23.3％)。Glu-D1位点上优势亚基为2+12(占82.8％)。供试材料品质评分变幅为}-8分，平均为6.2分。更为重要的是，发现4份材料同时具有7+8和5+10优质亚基，可供普通小麦品质育种利用。
　　 二、醇溶蛋白基因的分子克隆和序列分析根据小麦族己知α-和γ-醇溶蛋白基因保守区设计引物，对马卡小麦进行PCR扩增，成功获得了2个α-醇溶蛋白基因Gli-Mα1，Gli-Mα2。Genbank登录号分别为FJ595934和FJ595935;2个γ-醇溶蛋白基因Gli-Mr1，Gli-Mr2，Genbank登录号分别为FJ595937和FJ595936，因在编码区内均发现了提前终止密码子，故推测其都为假基因。马卡小麦的2个α醇溶蛋白基因与来源于小麦属普通小麦、乌拉尔图小麦、野生种二粒小麦等的相应基因进行比较发现它们在结构上有着较高的相似性，同时也存在一定的差异，这些差异主要来源于氨基酸残基以及重复区内重复单元的替换、缺失和插入。一致性统计表明两个α-醇溶基因同其它物种相应基因的一致性在68.61％-96.46％范围内变化，两个γ-醇溶蛋白基因与来源于小麦属不同品种相应基因之间同样具有较高的相似性，其一致性在77.71％-94.79％范围内变化。保守区进化分析表明，两个α-醇溶蛋白各自聚为一类，Gli-Mα1与来源于普通小麦的醇溶的α醇溶蛋白亲缘关系最近，而Gli-Mα2则与来源于Ⅴ染色体组的簇毛麦Dasypyrumbreviaristatum的α醇溶蛋白单独聚为一类;两个γ-醇溶蛋白同样各自聚为一类，与来源于T.turgidumsubsp.dicoccoides的FJ006564的亲缘关系最近，其次为Aeg,tauschii。Gli-Mr2与来自普通小麦品种的FJ006606的γ-醇溶蛋白亲缘关系最近。
　　 三、LMW-GS基因的分子克隆和序列分析利用己知LMW-GS基因序列保守区设计引物对2份马卡小麦基因组DNA进行扩增，成功克隆了2个LMW-GS基因Glu-LMl和Glu-LM2,Genbank序列号依次为FJ606796和FJ5995942。同小麦族其它LMW-GS基因进行比对分析后发现，其5'侧翼序列和氨基酸序列同其它亚基存在较高的一致性，同样具备LMW-GS的典型特征，同时也存在着一定的结构上的差异，这些差异主要来源与氨基酸残基的替换以及重复区结构单元的缺失或插入。在Glu-LMl基因序列侧翼区发现1个顺式作用元件EM(5'-TGTAAGT-3')。另外在2个基因种均出现2个TATAbox,Glu-LM1有3个3个CAATbox和2个AGGAbox，而Glu-LM2则有2个CAATbox和1个AGGAboxoGlu-LM1推导的氨基酸序列由20个氨基酸残基组成的信号肽，15个氨基酸残基组成的N末端，一个由69个碱基组成的重复区和由172个氨基酸残基组成的C端保守区。Glu-LM2的提前终止密码子出现在重复区和CterⅡ区域，推测其为假基因。分子进化分析表明，马卡小麦的Glu-LMl和与来源于小麦族的A和D染色体族的Aegilopstauschii和T.aestivum聚为一类。Glu-LM2与T.durum的亲缘关系较近。
　　 四、CM16基因的分子克隆和序列分析马卡小麦是普通小麦改良的重要遗传资源。小麦种子中含有丰富的抗虫α-淀粉酶抑制因子，能抑制多种来自昆虫和哺乳动物的α-淀粉酶，但关于马卡小麦抗虫基因的利用国内外还未见报道。本研究对2份马卡小麦材料的抗虫α-淀粉酶抑制因子编码基因CM16进行分离克隆，得到2个CM16基因，并分别进行了核苷酸和蛋白质序列分析，结果发现:α-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因CM16的序列无论在马卡小麦种内还是与小麦属其它物种之间，都具有很高的一致性，说明该基因在进化中十分保守。

目录

第1章 文献综述

1.1 醇溶蛋白研究概述

1.1.1 分类

1.1.2 染色体定位

1.1.3 氨基酸序列结构

1.1.4 与面份品质的关系

1.1.5 已报道的醇溶蛋白基因

1.1.6 醇溶蛋白的异质性

1.2 低分子量谷蛋白研空进展

1.2.1 LMW-GS的染色体定位

1.2.2 LMW-GS的分子结构

1.2.3 LMW-GS与小麦品质的关系

1.3 a-淀粉酶抑制剂基因CM16

1.3.1 抗虫转基因植物的研究进展

1.3.2 a-淀粉酶抑制剂

1.3.3 CM16特异性的分子机制

1.3.4 CM与抗虫基因工程

1.4 马卡小麦研究进展

1.4.1 马卡小麦分布、起源与分类研究

1.4.2 马卡小麦抗性研究

1.4.3 马卡小麦品质研究

1.4.4 马卡小麦基因资源利用研究

1.5 立题依据

第2章 种子贮藏蛋白A-PAGE和SDS-PAGE分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 供试材料

2.2.2 醇溶蛋白检测

2.2.3 高分子量谷蛋白亚基检测

2.3 结果与分析

2.3.1 醇溶蛋白分析

2.3.2 高分子量谷蛋白亚基分析

2.4 讨论

2.4.1 马卡小麦醇溶蛋白遗传多样性

2.4.2 马卡小麦HMW-GS的变异

第3章 醇溶蛋白基因的分子克隆和序列分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 供试材料

3.2.2 DNA提取

3.2.3 PCR扩增和克隆

3.3 结果与分析

3.3.1 PCR扩增及克隆

3.3.2 序列分析与比较

3.3.3 分子进化分析

3.4 讨论

3.4.1 醇溶蛋白基因的序列同源性

3.4.2 半胱氨酸残基的数目和位置

3.4.3 密码子的替换与假基因

3.4.4 醇深蛋白基因对面粉品质的影响

第4章 LMW-GS基因的分子克隆和序列分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 DNA提取

4.2.2 PCR扩增和克隆

4.2.3 DNA测序与分析

4.3 结果与分析

4.3.1 PCR扩增及克隆

4.3.2 序列分析与比较

4.3.3 分子进化分析

4.4 讨论

第5章 CM16基因的分子克隆和序列分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 DNA提取

5.2.2 PCR扩增和克隆

5.2.3 DNA测序与分析

5.3 结果与分析

5.3.1 PCR扩增与克隆

5.3.2 序列分析与比较

5.4 讨论

5.4.1 CM16核苷酸序列分析

5.4.2 CM16氨基酸序列分析

5.4.3 结论

参考文献

致谢

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