玉米脱水应答元件结合因子靶基因的全基因组分析

摘要

脱水应答元件结合因子(Dehydration responsive element binding factor,DREB)是植物非生物胁迫信号转导最为重要的转录因子之一,与许多抗逆相关基因的表达调节有关。目前,已经从多个物种中克隆了DREB基因家族成员,并验证其在非生物逆境胁迫下对抗逆相关基因表达的调控作用。在玉米上,已克隆出DBF1、DBF2、ZmDREB1A和ZmDREB2A四个DREB基因,并验证除DBF2外,其余3个基因编码蛋白的非生物胁迫逆境诱导转录因子功能。但是,关于DREB的靶基因及具体的信号调控途径,可供参考的文献十分有限。迄今为止,在玉米上严格鉴定的DREB靶基因只有rab17。在全基因组的水平上扫描鉴定DREB的靶基因,有助于了解DREB调控抗逆相关基因表达的具体情况,解析植物逆境应答的分子机制。
　　 通过对各种不同物种DREB蛋白的氨基酸序列分析发现,DREB具有一个保守的APETALA2(AP2)结合域,特异性地识别结合抗逆相关基因启动子序列上的顺式脱水应答元件(Dehydration responsive element,DRE)CCGAC,激活下游靶基因的表达。此外,在靶基因启动子序列上识别过程中,是由多个转录因子相互协同作用,结合到相应的顺式作用元件后,从而启动基因表达的。因此,随着玉米基因组测序完成,我们可以根据DREB所识别的顺式元件DRE及其侧翼序列的保守性,并结合生物信息学方法,能够在全基因范围内对DREB转录因子调控的靶基因进行扫描。
　　 汪世臣(2009)将已经确定的DREB靶基因中的DRE元件及其两侧各100 bp定义为DRE框序列(DRE frame sequence,DFS)。利用HexDiff算法计算出DFSs数据集和随机生成的具有DRE元件的nDFSs数据集中各种不同序列hexamers出现的频率比值。收集其中比值大于3.0的hexamers,作为鉴别DFS的特征,并利用这些特征构建支持向量机(Support vector machine,SVM)训练模型,开发了鉴别DREB结合位点的支持向量机分类器。
　　 本研究首先从斯坦福大学玉米全长cDNA数据库中下载了11472条全长cDNA序列,通过与玉米基因组序列数据比对,我们将8416条全长cDNA定位到了玉米基因组的单一位点上,并将其转录起始位点上游1000 bp作为启动子区域,搜索其中DREB识别的核心序列CCGAC。运用汪世臣开发的DREB结合位点支持向量机分类器,对核心序列两侧各100 bp共205 bp的DRE框序列进行分类鉴别。按此方法,从玉米全基因组共预测出694个可能的DREB靶基因。然后,从各种相关数据库中搜索下载,分别建立在低温、干旱和高盐胁迫下上调表达的玉米表达序列数据库,与预测出的694个可能DREB靶基因进行序列比对。结果表明,在694个预测的DREB靶基因中,有64、277和578个基因,分别在低温、干旱和高盐胁迫下上调表达。在这三种非生物逆境下上调表达的预测DREB靶基因共有596个,占全部694个预测DREB靶基因的85.9％。
　　 为了验证预测结果,我们首先根据DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A玉米上验证功能的3个DREB转录因子蛋白的氨基酸序列,进行密码子优化,体外化学合成DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A基因,构建原核表达载体,诱导表达,分离纯化了DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A蛋白。然后从预测的596个可能的DREB靶基因中,随机挑取出17个基因,并根据其启动子中的DRE顺式元件及其两侧序列合成探针。最后将这些探针分别与DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A蛋白进行硝酸纤维素膜透过实验,验证其体外结合的可能性。结果表明,验证实验所选取的17个基因其启动子均能不同程度地与DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A蛋白结合,说明我们对596个可能DREB靶基因的预测是可信的,进而为玉米非生物逆境胁迫应答的分子机理研究提供参考。