Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞的增殖凋亡、脂质代谢及类固醇激素合成研究

摘要

禽类卵泡的发育伴随着颗粒细胞的增殖与凋亡、卵泡内脂质的增多及卵泡内类固醇激素含量的改变。众多研究表明，leptin在卵泡发育过程中扮演着重要的调控角色，然而其调控结果却不甚一致:对颗粒细胞有促增殖抑凋亡、抑增殖促凋亡及作用不明显三种调控结果，对卵泡内类固醇激素及胞内脂肪酸有促合成与抑合成两种调控结果。此外，普遍认为禽类卵巢没有合成脂质的能力，卵泡脂质几乎全部源于肝脏，此种观点有待于进一步考证。为研究leptin对卵泡发育的调控作用及机理，本试验分别从组织、细胞、基因及激素水平入手，探讨leptin与颗粒细胞增殖与凋亡、卵泡内类固醇激素含量改变及卵泡内脂质代谢之间的关系。研究内容为:(1)通过鹅颗粒细胞培养、leptin及PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂处理，采用BrdU标记及实时定量等实验方法，分析“leptin-PI3K/Akt/mTOR信号通路-卵泡颗粒细胞增殖与凋亡”之间的关系;(2)通过鹅颗粒细胞培养、leptin及PI3K/Akt/mTOR信号抑制剂处理，运用油红O染色及实时定量等实验手段，分析“leptin-PI3K/Akt/mTOR信号通路-卵泡脂质代谢”之间的关系;(3)通过鹅颗粒细胞培养、leptin及PI3K/Akt/mTOR信号抑制剂处理，采用ELISA及实时定量等技术手段，分析“leptin-PI3K/Akt/mTOR信号通路-卵泡类固醇激素含量”之间的关系。
　　取得的主要研究结果如下:
　　(1)鹅各级卵泡颗粒细胞中表达leptin-R。4-6 mm卵泡表达量最高，随后呈下降趋势，但在F5中略有回升。
　　(2) Leptin调控鹅体外培养颗粒细胞中leptin-R、增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信号通路成员相关基因的转录表达，但具有剂量效应。低浓度leptin(1或10 ng/mL)处理组，leptin-R、CD1、CD2、CD3、Bcl-2及PI3K/Akt/mTOR信号通路成员相关基因的表达量显著高于对照组;高浓度leptin(100 ng/mL)处理组，上述基因的表达量显著低于低浓度leptin(1或10 ng/mL)处理组(p＜0.05)。
　　(3) PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制鹅体外培养颗粒细胞中CD1、CD2、CD3及Bcl-2的转录表达。LY294002及Rapamycin处理组，上述基因表达量显著高于对照组(p＜0.05)。
　　(4)体外无血清培养的鹅颗粒细胞有合成脂质的能力，脂滴含量随着培养时间的延长而增多（贴壁培养0h脂滴较少，24 h脂滴增多并主要聚集在细胞膜附近，48 h后脂滴充满整个细胞）;细胞数量随着培养时间的延长而减少。
　　(5)体外无血清培养的鹅颗粒细胞中脂质代谢相关基因的转录表达量高低不等。贴壁48 h后，脂肪酸从头合成关键基因(ACC、FAS)、TG合成限速酶基因（DGAT1、DGAT2）、脂质沉积正调控基因（PPARα、PPARγ）在鹅卵泡颗粒细胞中的表达量较高;脂肪酸β氧化限速酶基因（CPT1）的表达量较低;脂质转运基因(MTP、apoB)的表达几乎检测不到。
　　(6) Leptin调控鹅体外培养颗粒细胞中脂质代谢相关基因的表达，但具有剂量效应性。低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组，ACC、FAS、DGAT1、DGAT2、PPARα及PPARγ的表达量显著高于对照组(p＜0.05)，CPT1的表达量显著低于对照组(p＜0.05);高浓度leptin（100 ng/mL）处理组,ACC、FAS、DGAT1、DGAT2、PPARα及PPARγ的表达量显著高于低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组(p＜0.05)，CPT1的表达量显著高于低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组。
　　(7) PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制鹅体外培养颗粒细胞中ACC、FAS、DGAT1、DGAT2、PPARα及PPARγ的转录表达，促进CPT1的转录表达。
　　(8) Leptin调节鹅体外培养颗粒细胞中E2、P4及T的分泌。低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组，E2及P4的分泌量高于对照组;高浓度leptin(100 ng/mL)处理组，E2及P4的分泌量低于低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组;T的分泌量随着leptin浓度的增加而降低。
　　(9) Leptin调控类固醇合成基因(SREBP-1、HMGCS、CYP51、DHCR24)、类固醇转运基因（StAR、CYP11）及类固醇激素合成基因（17β-HSD、CYP17、CYP19、17β-HSD）的表达，但具有剂量效应。低浓度（1或10 ng/mL）leptin处理组，SREBP-1、HMGCS、CYP51、DHCR24、StAR、CYP11、17β-HSD、CYP17、CYP19、3β-HSD）高于对照组;高浓度(100 ng/mL) leptin处理组，上述基因的表达量低于低浓度leptin（1或10 ng/mL）处理组。
　　(10) PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制鹅体外培养颗粒细胞中E2、P4及T的分泌，抑制StAR、CYP11、CYP19及3β-HSD的表达。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 前言

2 禽类卵泡的简介

2．1 禽类卵泡的命名

2．2 禽类卵泡的结构

2．3 禽类卵泡的闭锁

3 瘦素简介

3．1 瘦素的发现及表达组织

3．2 瘦素的生物学功能

4 PI3K／Akt／mTOR信号通路简介

5 卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡

5．1 颗粒细胞增殖凋亡与卵泡的发育

5．2 Leptin与卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡

5．3 PI3K／Akt／mTOR信号通路与卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡

5．4 Leptin、PI3K／Akt／mTOR信号通路与细胞的增殖与凋亡

6 卵泡脂质

6．1 卵泡脂质含量

6．2 卵泡脂质来源

6．3 脂质代谢

6．4 Leptin与脂质代谢

6．5 PI3K／Akt／mTOR信号通路与脂质代谢

7 卵泡类固醇激素

7．1 类固醇激素的合成

7．2 Leptin与类固醇激素合成

7．3 PI3K／Akt／mTOR信号通路与类固醇激素的合成

8 研究目的意义及主要内容

8．1 研究目的意义

8．2 研究主要内容

第二章 Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 鹅卵泡颗粒细胞中表达leptin-R

3．2 Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞增殖相关基因的表达

3．3 Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞细胞凋亡相关基因的表达

3．4 Leptin调控PI3K／Akt／mTOR信号通路相关基因的表达

3．5 Leptin调节leptin-R的转录表达

3．6 LY294002、Rapamycin促进鹅颗粒细胞的增殖

3．7 LY294002、Rapamycin上调鹅颗粒细胞凋亡相关基因表达

4 讨论

4．1 鹅卵泡样品、leptin及培养液的选择

4．2 Leptin与鹅卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡

4．3 Leptin与PI3K／Akt／mTOR信号通路

4．4 PI3K／Akt／mTOR信号通路与鹅卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡

5 小结

第三章 Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞脂质代谢的研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 鹅卵泡颗粒细胞内脂滴的发现

3．2 脂质代谢相关基因的表达

3．3 Leptin处理后鹅卵泡颗粒细胞脂滴沉积的变化

3．4 Leptin调节鹅卵泡颗粒细胞中脂质代谢相关基因的表达

3．5 LY294002、Rapamycin调节脂质代谢相关基因的表达

4 讨论

4．1 鹅卵泡样品的选择

4．2 鹅卵泡脂质

4．3 Leptin与鹅卵泡颗粒细胞中的脂质代谢

4．4 PI3K／Akt／mTOR信号通路与鹅卵泡脂质代谢

5 小结

第四章 Leptin调控鹅卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 Leptin-R mRNA的组织表达

3．2 Leptin-R mRNA在卵泡发育中的表达

3．3 Leptin调节类固醇激素的分泌

3．4 Leptin调节类固醇激素合成相关基因的转录表达

3．5 LY294002、Rapamycin 调节类固醇激素的分泌

3．6 LY294002、Rapamycin调节类固醇激素合成相关基因的表达

4 讨论

4．1 Leptin-R的组织表达

4．2 Leptin与鹅卵泡颗粒细胞的类固醇激素

4．3 PI3K／Akt／mTOR信号通路与鹅卵泡颗粒细胞的类固醇激素

5 小结

参考文献

第五章 总结

1 主要结论

2 创新点

3 下一步要进行的工作

致谢

攻读学位期间发表的论文