鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白的免疫原性研究

摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella antipestifer,RA）能引起鸭、鹅、火鸡等多种禽类发生鸭疫里默氏杆菌感染，呈急性或慢性败血性经过。本研究对RAOmpA基因开展了生物信息学分析、克隆表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备、基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立、重组蛋白免疫原性等研究，主要结果如下:
　　1 RA OmpA基因的生物信息学分析
　　RAOmpA全基因长1208bp，由397个氨基酸编码大小为43.52kDa的蛋白，等电点(pI)为4.81。该蛋白没有信号肽切割位点和跨膜区，有如下功能位点:有4个N-糖基化位点，9个蛋白激酶C磷酸化位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，3个N-豆蔻酰化位点。亚细胞定位分析该蛋白主要分布于外膜和细胞之内。氨基酸进化树分析表明该蛋白与黄杆菌科编码OmpA蛋白的其它成员相似性低。该蛋白的抗原性分析表明第185-337位这段氨基酸有连续而且强烈的抗原性。
　　2 RA OmpA基因的克隆表达和多抗的制备
　　对RAOmpA基因设计了一对引物，大小为1208bp，构建pJET1.2/OmpA克隆载体及其pET32a(+)OmpA表达载体，转入表达菌株BL21内进行原核表达，优化的表达条件:在37℃，IPTG终浓度为0.4mmol/L诱导4h的最优条件下重组蛋白能够大量表达。经SDS-PAGE分析蛋白大小约63kDa，并主要以可溶性形式表达于上清，并用切胶的方法纯化该蛋白。纯化的蛋白用兔抗RAATCC菌为一抗，HRP-抗兔为二抗经Western blot证实，该蛋白具有较好的反应原性。最后，将纯化的蛋白制备兔抗多克隆抗血清，用琼扩的方法测定效价为1∶16。
　　3基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立
　　用纯化的重组蛋白作为包被抗原，用鸭抗RA ATCC全菌血清作为一抗，HRP-羊抗鸭为二抗进行条件的优化，最后结果为，当包被的浓度为3.6125μg/mL;一抗最佳稀释度为1∶100，最佳反应时间为1.5h;二抗最佳稀释度1∶400，最佳反应时间为2h;用1％BSA为封闭液;底物作用时间为30min时的反应条件最佳;并用优化好的条件对26份阴性血清做了阴阳性临界值确定，根据公式，当OD450＞0.379时可判为阳性，当OD450≤0.294时可判为阴性;重复性试验结果表明变异系数均小于11％，表明该方法具有较好的重复性;对其它5种常见鸭病的阳性血清均无交叉反应性，说明具有较好的特异性。
　　4重组蛋白免疫原性的研究
　　用纯化的重组蛋白作为免疫原，对雏鸭进行免疫，实验分组:OmpA蛋白组、OmpA蛋白加佐剂组和阴性组。对体液免疫和细胞免疫进行监测，结果表明，所有的结果在二免后都具有显著的升高，而且二免后OmpA蛋白组、OmpA蛋白加佐剂组测得的结果具有较显著的差异。说明仅有OmpA单独作为抗原还是不能引起较强的免疫反应性。

目录

声明

摘要

英文缩写词汇及其含义说明

一、引言

1 鸭疫里默氏杆菌研究概况

2 OmpA基因编码蛋白的特点

2．1 OmpA蛋白的结构特点

2．2 OmpA蛋白的功能

3 OmpA的基因特点

4 OmpA其它特性

4．1 中性粒细胞弹性蛋白酶降解外膜蛋白杀灭大肠杆菌

4．2 膜间质分子伴侣Skp捕获外膜蛋白

4．3 外膜蛋白参与革兰氏阴性菌对异丙醇耐受的调节

5 研究的目的和意义

二、试验研究

1 材料

1．1 菌株、菌种、质粒、血清和动物

1．2 试剂

1．3 主要溶液的配制

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析

2．2 RA OmpA基因的克隆和表达

2．3 OmpA重组表达蛋白的纯化及鉴定

2．4 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立

2．5 重组表达蛋白的免疫原性研究

3 结果

3．1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析

3．2 RA OmpA基因克隆表达、蛋白纯化及抗体制备

3．3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立

3．4 重组表达蛋白的免疫原性研究

4 讨论

4．1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析

4．2 RA OmpA基因的克隆表达、蛋白纯化及抗体制备

4．3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立

4．4 重组表达蛋白的免疫原性研究

三、结论

参考文献

致谢

作者简介及攻读硕士学位期间论文发表