豆芽三种激素(GA3、6-BA、2,4-D)的HPLC方法建立及指纹图谱构建

摘要

植物激素被广泛运用于现代农业生产上，但激素的超标使用，会对人体及牲畜的健康产生不良影响，引发疾病。豆芽生产中常使用的三种激素有:赤霉素(GA3，C19H22O6)、6-苄基腺嘌呤（6-BA，C12H11N5）、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D，C8H6C12O3)。本实验在固定波长、等柱洗脱条件下，建立一种高效、便捷、同时测定豆芽中该三种激素的高效液相色谱方法，对其优化，并进行方法学评价;在所建立方法的基础上，绘制豆芽三种激素检测的安全指纹图谱，并进行验证实验。主要研究结果如下:
　　1.优化了同时检测三种激素（GA3、6-BA、2，4-D）的色谱条件。优化结果为:ZORBAXSB-C18(4.6×150mm，5um)色谱柱、35℃柱温、1.0mL/min流速、200nm波长、甲醇∶乙腈∶水（0.08％甲酸水溶液）=40∶10∶50(V∶V∶V)为流动相。此条件下，三种激素GA3、6-BA、2，4-D的保留时间分别为:3.557min、5.098min、20.798min;理论塔板数分别为:2916.973、3919.87、5419.053;分离度分别为:0、4.447、18.327，拖尾因子、不对称度均接近于1，峰型正常。
　　2.对样品预处理条件进行优化。在初步确定预处理步骤后，考察浸提液体积、超声提取温度、超声提取时间、超声提取次数、超声提取功率、离心转数、石油醚萃取次数、乙酸乙酯萃取次数、旋转蒸发温度9个因素对回收率的影响，并在单因素试验基础上，运用响应面分析法进行优化。优化得到的最佳前处理条件为:浸提液体积15mL、超声提取温度30℃、超声提取时间25min、超声提取4次、超声提取功率为270W（总功率的30％）、离心转数4500r/min、石油醚萃取3次、乙酸乙酯萃取3次、旋转蒸发温度40℃。此时加标回收率GA3为78.897％、6-BA为83.712％、2，4-D为95.916％。
　　3.方法学评价。结果表明:三种激素在0.0025～0.0150ug范围内呈现良好的线性关系。GA3、6-BA、2，4-D三种激素线性方程分别为:Y=3×106X+370.26（r=0.9999）、Y=7×106X-10249(r=0.9997)、Y=1×107X+1019.4(r=0.9997); LOD（最低检出限）值分别为9.34×10-4ug/L、3.25×10-4 ug/L、1.75×10-4 ug/L。GA3、6-BA、2，4-D三种激素精密度实验结果RSD（相对标准偏差）值分别为0.97％、0.40％、0.36％;重复性实验结果RSD值分别为1.80％、1.45％、1.96％;日内稳定性实验结果RSD值分别为1.20％，0.49％，0.97％。分别加标4.0、5.0、6.0mg/kg情况下，GA3加标回收率结果为:74.96％、77.12％、75.50％，RSD为:1.4％、2.9％、1.7％;6-BA加标回收率结果为:80.58％、80.15％、82.07％，RSD为:2.4％、3.1％、1.2％;2，4-D加标回收率结果为:93.14％、91.01％、94.56％，RSD为:2.2％、2.0％、1.9％。样品验证实验结果表明:雅安市售豆芽中，激素GA3、6-BA均未超标;2，4-D超标较严重。
　　4.豆芽安全指纹图谱构建。将实验室自制豆芽的HPLC图谱导入相似度计算软件，采用平均值法，得到其对照指纹图谱，即豆芽安全指纹图谱，各样本与该对照指纹图谱的相似度均达到0.9以上，符合要求。在相同条件下，三种激素出峰时间不变，故本实验在不使用标准品前提下，将此安全指纹图谱与市售豆芽HPLC图谱在三种激素出峰时间处进行对比，可以直接得到所检测的市售豆芽样品中是否含有该三种激素。验证实验结果为:选取的11份市售豆芽样品中，有4份含有激素GA3;1份含有激素6-BA。验证实验证明该安全指纹图谱在豆芽激素（GA3、6-BA、2，4-D）的检测方面具有实用价值。

目录

声明

摘要

缩略词

1 文献综述

1．1 豆类芽苗菜简介

1．2 三种激素的检测及指纹图谱的研究进展

1．2．1 三种激素的相关研究进展

1．2．2 指纹图谱构建研究概况

1．3 立题意义及研究内容

1．3．1 立题意义

1．3．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 材料、试剂与仪器

2．1．1 实验原料

2．1．2 药品试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 研究方法

2．2．1 标准贮备液配制

2．2．2 色谱条件的优化

2．2．3 样品预处理条件的优化

2．2．4 方法学评价

2．2．5 安全指纹图谱研究

3 结果与分析

3．1 色谱条件的优化结果及分析

3．1．1 色谱条件的优化

3．1．2 最佳色谱条件的确定

3．2 样品预处理条件的优化结果及分析

3．2．1 样品前处理步骤的优化

3．2．2 单因素试验结果及分析

3．2．3 响应面试验结果及分析

3．2．4 最佳预处理条件的确定

3．3 方法学评价结果及分析

3．3．1 系统适应性考察

3．3．2 标准曲线的绘制

3．3．3 精密度实验

3．3．4 重复性实验

3．3．5 稳定性实验

3．3．6 加标回收率实验

3．3．7 样品验证实验

3．4 安全指纹图谱研究结果及分析

3．4．1 安全指纹图谱的绘制

3．4．2 安全指纹图谱验证性实验

4 讨论

4．1 检测方法的确定

4．2 前处理的优化

4．3 指纹图谱的构建及其应用价值

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢