猪支气管败血波氏杆菌LAMP检测方法的建立及流行病学调查

摘要

猪支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）能够广泛感染哺乳动物，并且造成急慢性的呼吸道疾病。人偶尔有感染该菌的报道，尤其是有免疫力缺陷的人群和小孩。支气管败血波氏杆菌和其他病原体之间具有协同作用，可以增加呼吸系统的发病率和严重程度。例如，能够和巴氏杆菌引起猪的传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis，AR)，该病可导致育肥猪生长迟滞，降低饲料的利用率，给养猪业造成巨大的经济损失。
　　本研究分成两个部分，具体如下:
　　第一部分，本研究通过DNAstar等软件对猪支气管波氏杆菌的鞭毛基因序列（flagellum gene，Genbank登陆号:EU327790，AJ012319，L13034）进行比对分析，在LAMP引物设计网站设计LAMP引物。经过LAMP反应体系条件的优化，确定了25μl的反应体系。进行了LAMP方法的特异性试验，结果显示，仅Bb产生特异性条带，说明所建Bb的LAMP方法具有高度的特异性。进行了LAMP方法的敏感性试验，结果显示，常规PCR方法检测Bb的极限为9×102个拷贝，LAMP的检测灵敏度为9.0×10个拷贝，表明LAMP方法的检测灵敏度是常规PCR检测方法的10倍。最后进行了LAMP方法的临床试验，通过对31份猪肺脏病料与46份疑似感染猪鼻腔拭子分别进行细菌分离、PCR、LAMP三种方法检测后，发现猪肺中细菌分离、PCR方法、LAMP方法的检出率分别为9.67％(3/31)、19.4％(6/31)、32.3％(10/31)，而疑似感染组中三种方法的阳性率为19.57％(9/46)、58.14％(20/46)、69.77％(28/46)，且LAMP与细菌分离、PCR方法的阳性符合率为100％，说明本LAMP方法更加适合于Bb的临床检测。
　　第二部份，2012年4至2013年4月间，利用本研究所建立的LAMP方法及参照Townsend等提出的检测产毒素性巴氏杆菌的PCR方法分别对来至四川省的438份鼻腔拭子样品进行了Bb与产毒素性巴氏杆菌(T+Pm)检测。本研究通过对四川省部分地区的规模化猪场的Bb及T+Pm进行流行病学调查，初步掌握了Bb及T+Pm在四川省的流行状况，从Bb的调查结果看来，小规模养殖场30日龄以下、30-90日龄、90日龄以上仔猪的Bb阳性率分别为24.29％(17/70)、39.19％(29/74)及21.79％(17/78)，而大规模养殖场30日龄以下、30-90日龄、90日龄以上仔猪的Bb阳性率分别为32.31％(21/65)、40.26％(31/77)、20.27％(15/74)，应用凝集试验检测血清样品，检测结果结果显示，438份血清样品的总阳性率为51.59％，小规模养殖场30日龄以下、30-90日龄、90日龄以上仔猪的Bb抗体阳率分别为37.14％(26/70)、51.35％(38/74)、55.13％(43/78)，大规模养殖场的阳性分别为38.46％(25/65)、63.64％(49/77)、60.81％(45/74)。结合Bb与T+Pm阴性猪只临床表现，表明四川省猪群中还存在相当数量的隐性感染者或病原携带者，若不及时淘汰隐性感染猪，势必造成本病的爆发与流行，给猪场造成极大危害。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述及选题的目的和意义

1．猪支气管败血波氏杆菌的研究进展

1．1 支气管败血波氏杆菌病及危害

1．2 猪支气管败血波氏杆菌的形态及培养特性

1．3 支气管败血波氏杆菌的毒力因子

1．4 猪支气管败血波氏杆菌检测方法的研究进展

1．5 AR疫苗的研究进展

2．LAMP检测方法的研究进展

2．1 LAMP检测方法的原理

2．2 LAMP的扩增特点

2．3 LAMP的不足与对策

2．4 LAMP的应用

3．本研究的目的与意义

第二章 猪支气管败血波氏杆菌LAMP检测方法的建立

1．实验材料

1．1 菌株与毒株

1．2 主要试剂及其来源

1．3 主要仪器及其来源

2．实验方法

2．1 菌种的培养

2．2 核酸的提取

2．3 LAMP引物的设计

2．4 LAMP反应体系的建立

2．5 LAMP检测方法特异性检验

2．6 LAMP检测方法灵敏性探索

2．7 临床样品的检测

3．结果与分析

3．1 LAMP法反应条件的优化结果

3．2 LAMP最佳反应体系

3．3 LAMP反应的特异性结果

3．4 LAMP反应的灵敏性结果

3．5 LAMP检测方法l临床样品的检测结果分析

4．讨论

第三章 四川省猪支气管败血波氏杆菌的流行病学调查

1．实验材料

1．1 临床样品

1．2 主要试剂及其来源

1．3 实验仪器及其来源

2．实验方法

2．1 猪群鼻腔拭子样品的采集与处理

2．2 鼻腔拭子样品DNA的提取

2．3 鼻腔拭子样品的LAMP检测

2．4 鼻腔拭子样品中多产毒素杀性巴氏杆菌的检测

2．5 Bb的血清学检测

2．6 检测的结果统计分析

3．结果与分析

3．1 LAMP方法检测出的样品中Bb病原学调查结果

3．2 样品中T+Pm阳性率

3．3 凝集反应检测出的样品中Bb血清学结果

4．讨论

参考文献

致谢