海豚链球菌CAMP因子原核表达及生物学特性研究

摘要

本研究以斑点叉尾鮰源海豚链球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）广西分离株DGX07为实验菌株提取总DNA作为模板，对CAMP因子基因进行PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增;将扩增产物连接至pMD19-T质粒中进行测序，并应用不同的生物信息学软件对其核酸及氨基酸序列进行分析;将含有限制性内切酶位点的csi基因连接至pMD19-T质粒中，酶切回收后将其连接至表达质粒pET32a(+)上，最终转化至大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）原核表达系统BL21(DE3)大肠杆菌内;将阳性表达菌株进行CAMP因子重组诱导表达，并优化表达条件;用重组CAMP因子蛋白免疫新西兰大白兔，并进行Western-blot以检验该蛋白的免疫原性以及在海豚链球菌中的表达情况;用Western-blot检验重组CAMP因子对IgG非特异性的粘附;用CAMP因子抗血清探究其对海豚链球菌对鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）粘附及侵染的抑制水平;用重组CAMP因子与重组金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）鞘磷脂酶(sphingomyelinase)探究其对不同物种血细胞的促溶血特性。
　　核酸及蛋白质序列分析表明，海豚链球菌CAMP因子隶属于CAMP因子超家族，并与其他链球菌CAMP因子同源，但是其与亲缘关系最近的犬链球菌（Streptococcus canis）的相似度仅为63％，且该蛋白质含有60.1％的可变氨基酸，这表明海豚链球菌CAMP因子不属于保守蛋白质;NCBI在线预测软件分析表明，CAMP因子含有信号肽序列，1个潜在N-糖基化位点，以及16个潜在磷酸化位点;SDS-PAGE显示，海豚链球菌重组CAMP因子的蛋白大小为48kDa，且大肠杆菌原核表达系统在IPTG浓度为0.8mmol/L、37℃下诱导表达5h时，表达水平达到最大;琼脂扩散实验结果表明，CAMP因子抗血清效价为1∶32;Western-blot结果显示，重组CAMP因子具有抗原性，且海豚链球菌存在CAMP因子的表达;细胞实验中，被CAMP因子抗血清中和了的海豚链球菌显示出粘附以及入侵鲤鱼上皮瘤细胞能力减弱的现象，其中粘附水平下降至58.4％，而侵入水平下降更多，至42.7％，这表明CAMP因子在海豚链球菌侵入机体后粘附并进入上皮细胞中起着较为重要的作用;Western-blot结果显示，a-烯醇化酶抗血清与CAMP因子预孵育后，其与α-烯醇化酶结合的能力出现下降，这表明CAMP因子能够非特异性地结合兔源IgG;对不同种红细胞的促溶血结果显示，重组CAMP因子对羊、猪以及兔血红细胞的促溶血程度呈剂量以及时间相关性;而两种鱼类血细胞则对CAMP因子的促溶血作用呈完全抵抗的现象。综上所述，海豚链球菌CAMP因子可能丧失了对鱼类细胞的促溶血作用，而其在非特异性结合IgG，以及协助海豚链球菌粘附并侵染鱼类上皮细胞的过程中，CAMP因子则起着较为重要的作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．海豚链球菌的研究进展

1．1 海豚链球菌简介

1．2 海豚链球菌的全球传播

1．3 海豚链球菌的宿主

2．海豚链球菌主要致病因子

2．1 SiM蛋白

2．2 C5a肽酶

2．3 白细胞介素-8蛋白酶

2．4 链球菌溶血素S

2．5 免疫结合蛋白

2．6 荚膜

2．7 葡萄糖磷酸变位酶

2．8 表多糖

2．9 α-烯醇化酶

3．CAMP因子概述

3．1 CAMP因子简介

3．2 CAMP因子的溶血特性

3．3 CAMP因子溶血机理

3．4 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白

3．5 CAMP因子致病性

第二章 实验目的以及意义

第三章 cfi的克隆和生物信息学分析及其蛋白原核表达

1 实验材料

1．1 材料与试剂

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

2 实验步骤

2．1 cfi基因的扩增及序列分析

2．2 重组cfi基因的T载体克隆构建

2．3 cfi基因表达载体pET-32a(+)的构建

2．4 CAMP因子重组蛋白表达条件的优化

2．5 镍NTA琼脂糖凝胶过柱纯化重组蛋白

3 实验结果

3．1 海豚链球菌cfi基因的扩增

3．2 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析

3．3 pMD19-T-cfi克隆载体的构建

3．4 pET-32a(+)-cfi表达载体的构建

3．5 CAMP因子重组蛋白的表达与优化

3．6 重组蛋白的纯化

4 分析与讨论

4．1 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析

4．2 海豚链球菌CAMP因子原核表达

第四章 重组CAMP因子生物学特性研究

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

2 实验步骤

2．1 CAMP因子兔抗血清的制备

2．2 CAMP因子抗血清特异性检测

2．3 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白检测

2．4 鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)粘附／侵染实验

2．5 重组CAMP因子促溶血实验

3 实验结果

3．1 CAMP因子抗血清琼脂扩散实验

3．2 CAMP因子免疫原性实验

3．3 CAMP因子在海豚链球菌中表达情况的检验

3．4 CAMP因子非特异性结合IgG

3．5 CAMP因子协助海豚链球菌粘附／入侵EPC细胞

3．6 CAMP因子血平板促溶血检测

3．7 CAMP因子液体促溶血检测

4 分析与讨论

4．1 CAMP因子的免疫原性

4．2 CAMP因子非特异性结合IgG

4．3 CAMP因子协助海豚链球菌粘附／入侵EPC细胞

4．4 CAMP因子对不同动物红细胞促溶血作用

参考文献

致谢