玉米光周期途径中蓝光响应节律基因ZmFKF1的分子进化与关联分析

摘要

拓宽现有种质遗传多样性是实现高产、优质、高抗等玉米育种目标的基础，然而引进热带、亚热带玉米种质资源存在光周期敏感现象，严重制约了优异种资质源的利用。近年来，研究者利用基因组学的方法在不同物种中充分发掘光周期相关基因资源，解析基因调控网络，并开发相应的分子标记，为植物分子育种提供重要的理论和实践依据。本研究针对光周期重要节律调节基因FKF1，利用生物信息学手段，研究FKF1及其基因家族(LOV-F-box)的分子进化机制;利用同源克隆的方法，在多个物种中克隆了FKF1，并进行基因序列的遗传多样性和进化树分析;同时结合89份玉米核心种质的光周期相关表型性状，进行候选基因关联分析，从中发掘优异等位变异;通过RT-PCR初步研究光周期调控下ZmFKF1的时空表达特征;同时测定极端材料在不同光周期诱导下的多项生理指标，为探索新的光周期敏感性评价指标提供依据。主要研究结果如下:
　　1.根据拟南芥中已报道的AtZTL、AtLKP2和AtFKF1氨基酸序列，运用生物信息学方法在NCBI和JGI数据库中，筛选并鉴定出47个物种中115个LOV-F-box基因家族成员，在藓类和水生植物中均未鉴定到LOV-F-box类基因，推测该基因家族为陆生维管植物特有。115个LOV-F-box基因成员被聚为FKF1和ZTL/LKP2两大类，这两大类均可再被划分为单子叶和双子叶植物。推测FKF1与ZTL/LKP2的分化早于单、双子叶植物的分化，且单、双子叶植物分化形成后ZTL与LKP2才出现功能分化。其中基因组数据库中的32个物种FKF1系统进化分析发现，其聚类结果也按单、双子叶植物分开，且与数据库中物种基因组研究的聚类结果基本一致。
　　2.在玉米基因组中鉴定到两个ZmFKF1成员:ZmFKF1a和ZmFKF1b，本实验针对与拟南芥AtFKF1结构域一致的ZmFKF1b进行克隆和分子进化研究。利用同源克隆的方法在禾本科物种中分别克隆了包含UTR全长序列的ZmFKF1b，OsFKF1，AtFKF1和包含完整编码区的TaFKF1序列。进化树分析发现玉米和不同亚种的大刍草、摩擦禾被聚为一大类，再依次与水稻和小麦聚为一类，与拟南芥的亲缘关系最远，推测这与单、双子叶植物的进化距离和基因本身的进化印记有关。在89份玉米自交系ZmFKF1b分子进化研究中，不同来源的自交系被划分为温带、亚热带、热带/亚热带三大类，与基于全基因组SNP分类的群体结构高度一致，表明ZmFKF1b的适应性进化与生态环境相关。此外，核苷酸多态性分析、选择测验Tajima's D和进化树分析均表明ZmFKF1b受到选择作用，并且主要在基因编码区受到极显著的负向选择压，暗示该基因在进化过程中存在编码蛋白的功能分化。
　　3.利用89份玉米自交系对ZmFKF1b进行核苷酸多态性分析，共检测到的62个多态性位点。其中49个为SNP位点（平均64 bp一个SNP），13个为InDel位点（平均每244bp一个InDel）。发生在编码区的18个SNP位点中的12个为同义突变，两个外显子区域还分别含有一个InDel。ZmFKFb基因连锁不平衡分析表明，该基因中存在多个明显的LD区段，在3300 bp开始迅速衰退(R2=0.1)。结合光周期相关性状表型数据，在89份自交系中采用一般线性模型对496个测验（62个位点×5个性状×3个地点）进行ZmFKFb关联分析。研究发现，ZmFKF1b中有11个位点同时影响北京观测点的吐丝期和散粉期的变异(P＜0.001)，可解释的表型变异R2范围为15.91～22.05％。8个位点分别在2个不同观测点检测到与吐丝期和散粉期显著关联(P＜0.01)。12个位点与雄轴长显著关联(P＜0.01)，但未检测到与散粉-吐丝间隔(ASI)和株高显著关联的位点。
　　4.采用RT-PCR技术检测ZmFKF1b在不同光周期诱导下极端材料的叶与茎尖中的表达模式。结果表明:在钝感自交系Huangzao4中，7h短日照诱导下在叶片和茎尖中的相对表达量呈上升趋势，而在17h长日照处理的叶片和茎尖中被抑制表达;7h短日照诱导下，在敏感自交系CMT-L106叶片和茎尖中基本维持组成型表达，而在17 h长日照处理下有不同程度的下调表达。表明长、短日照光周期胁迫均未诱导ZmFKF1b在敏感材料中的表达，对玉米的生殖生长和开花时间产生较大影响;而对于钝感材料则主要抑制其在长日条件下的表达，推迟植株开花。
　　5.通过测定极端材料在不同光周期诱导下叶片的多项生理指标表明，在长日照条件下各材料叶绿素含量均高于短日照条件，敏感材料在不同光周期诱导下的差异更大。淀粉、可溶性蛋白和游离氨基酸含量均随叶龄期呈不断升高的趋势，在短日照处理下所有自交系的游离氨基酸含量均高于长日照处理下的游离氨基酸含量，钝感自交系在短日照处理下游离氨基酸含量较高，推测游离氨基酸参与调节光周期的抗逆反应。可溶性糖含量表现为处理初期降低，后期升高的规律性变化，且各自交系叶片可溶性糖含量最低的时期与植株雄穗分化时期一致，表明可溶性糖含量可以作为玉米光周期敏感性评价的生理指标。通过测定光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)等叶片光合性状研究光周期处理对光合效率的影响。结果表明在不同光周期处理条件下，随着处理时间的增加各测定指标均不断降低，且材料越敏感其光合效率越高。该结果表明，光合性状指标也可作为评价玉米光周期敏感性的指标。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 玉米光周期研究进展

1．1．1 外引种质的应用潜力

1．1．2 评价玉米光周期敏感性的重要指标

1．1．3 玉米光周期敏感时期的确定

1．1．4 光周期调控植物开花

1．1．5 光周期途径调控植物开花的分子机制

1．1．6 FKF1参与光周期调控的分子机制

1．2 分子进化研究进展

1．3 玉米关联分析研究进展

1．4 本研究的目的与意义

第二章 LOV-F-box蛋白基因家族的分子进化

2．1 材料与方法

2．1．1 LOV-F-box基因家族进化分析

2．1．2 FKF1在禾本科物种中的克隆与进化分析

2．2 结果与分析

2．2．1 LOV-F-box基因家族进化分析

2．2．2 FKF1在禾本科物种中的克隆与进化分析

2．3 结论与讨论

2．3．1 陆生维管植物特有基因家族LOV-F-box的进化关系

2．3．2 LOV-F-box类基因成员在基因组中复制的可能性机制

2．3．3 禾本科物种间同源基因的功能具有更高的相似性

第三章 玉米ZmFKF1b基因多态性与光周期性状关联分析

3．1 材料与方法

3．1．1 田间表型鉴定

3．1．2 ZmFKF1b序列多态性与选择性检验

3．1．3 ZmFKF1b基因的LD分析

3．1．4 ZmFKF1b基因的分子进化分析

3．1．5 玉米ZmFKF1b与光周期性状关联分析

3．2 结果与分析

3．2．1 ZmFKF1b的序列多态性分析

3．2．2 ZmFKF1b基因选择性检验

3．2．3 ZmFKF1b基因LD分析

3．2．4 玉米ZmFKF1b的进化分析

3．2．5 玉米ZmFKF1b与光周期性状关联分析

3．3 结论与讨论

3．3．1 ZmFKF1b基因的LD水平及影响因素

3．3．2 玉米ZmFKF1b在进化过程中受到强烈的选择作用

3．3．3 ZmFKF1b基因的多态性与功能性变异分析

第四章 玉米ZmFKF1b在不同光周期条件下的表达分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料的选取与准备

4．1．2 RNA提取和cDNA制备

4．1．3 实时荧光定量PCR(RT-PCR)

4．2 结果与分析

4．2．1 育苗处理与苗情观察

4．2．2 植物总RNA的提取与检测

4．2．3 引物的特异性及扩增效率检测

4．2．4 ZmFKF1b的时空特异性表达

4．3 结论与讨论

4．3．1 ZmFKF1b的表达受到光周期诱导

4．3．2 探讨ZmFKF1b时空特异性表达模式的新策略

第五章 玉米光周期敏感性生理指标测定

5．1 材料与方法

5．1．1 叶绿素含量的测定

5．1．2 叶片中游离氨基酸含量测定

5．1．3 叶片可溶性糖和淀粉含量测定

5．1．4 玉米叶片可溶性蛋白含量测定

5．1．5 不同光周期处理下玉米叶片光合特性

5．2 结果与分析

5．2．1 标准曲线的制备

5．2．2 叶绿素含量差异分析

5．2．3 游离氨基酸、可溶性蛋白含量变化

5．2．4 可溶性糖、淀粉含量变化

5．2．5 不同光周期处理下玉米叶片光合特性分析

5．3 结论与讨论

5．3．1 不同光周期处理下玉米生理指标变化

5．3．2 可溶性糖含量是玉米光周期敏感性评价的重要指标

5．3．3 光合相关生理指标间的联系

后续研究

参考文献

致谢