LH信号通路抑制剂对鸡F1卵泡中颗粒细胞时钟基因表达的影响

摘要

鸟类的排卵是由体内的LH峰促发，在卵泡中排卵周期受到时钟基因转录水平和生物节律影响。本研究以家鸡的排卵前卵袍(F1)颗粒细胞为研究对象，采用无血清培养基培养的方法，通过cAMP、p38MAPK、ERK1/2通路抑制剂和LH激素的处理，探讨LH信号级联通路在节律时钟基因中的作用。主要研究结果如下:
　　采用qPCR方法检测了时钟基因(Bmal1、 Clock、Cry1、Per2和Rev-erbβ)、时控基因（Star）、Egr-1（LH刺激卵泡的应答基因）和LHr（LH激素受体基因）在颗粒细胞中的表达量。结果表明对照组中Clock、Cry1、Per2、Star和Rev-erbβ均在CT12的时候出现了一个峰值，时钟基因在24小时里具有显著的节律性和转录水平变化。作为LH激素刺激的应答基因Egr-1逐渐升高并在CT12也出现一个表达峰，表明在排卵前颗粒细胞中细胞自主节律无时无刻的存在，也就是说颗粒细胞在无需要外接调节或者刺激就具有生物节律这一特性。在24小时培养周期里，LH激素诱导时钟基因转录水平升高，尤其Bmal1和Per2基因的转录水平被快速上调，且LH刺激改变了时钟基因的周期时间，其中LH激素处理组与对照组比较时钟基因的峰值提前4小时，以及出现第二个节律较弱的峰值。由此看出LH激素诱导改变了颗粒细胞的自主节律的振幅和时钟基因的周期时间。
　　通过抑制剂抑制cAMP、 p38MAPK和ERK1/2通路，进一步探究LH信号级联通路之间的相互关系关系以及对时钟基因生物节律的影响。结果发现，LH能快速上调Areg、EGFr和Egr-1基因的表达水平;而在抑制ERK1/2通路后，Areg的转录水平被显著下调;EGFr基因的表达则受三条通路影响，其中Areg的转录水平被显著下调;Egr-1基因的转录水平同时能被这三条通路影响。在抑制cAMP通路后，时钟基因的转录水平被抑制，在24小时里生物节律性减弱，但分别抑制了p38MAPK和ERK1/2通路后，时钟基因的转录水平升高，也就是说LH激素对时钟基因的影响可能会被放大，它们24小时里具有相似的表达模式，可能p38MAPK和ERK1/2通路位于信号通路统一位置，且对时钟基因的调控上面扮演者类似的角色，同时抑制p38MAPK和ERK1/2通路，表明时钟基因的转录水平都能被显著抑制。因此在鸡排卵过程中，LH信号对时钟基因的影响主要受到cAMP通路调控，而p38MAPK和ERK1/2通路的参与对于时钟基因节律的通过也至关重要。

目录

论文说明

声明

摘要

高频词对照表

1 文献综述

1．1 生物节律

1．1．1 生物节律的类型及其对生物的生理过程调节的重要性

1．1．2 生物节律的内源性以及其运行机制

1．1．3 影响生物时钟的因素

1．1．4 生物节律的应用

1．2 生物时钟

1．2．1 时钟机制的普遍存在性

1．2．2 时钟基因

1．2．3 生物节律周期探测方法

1．3 卵巢及卵泡功能的调节

1．3．1 卵泡颗粒细胞

1．3．2 卵黄形成过程

1．3．3 下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)对性腺发育的调控机理

1．3．4 性腺激素

1．3．5 促黄体生成素(LH)下游信号通路

1．4 本研究的目的意义和主要内容

1．4．1 研究的目的意义

1．4．2 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 蛋鸡产蛋记录

2．2．2 卵泡颗粒层细胞HE染色

2．2．3 鸡卵巢颗粒细胞培养

2．2．4 激素和抑制剂处理

2．2．5 RNA提取和qPCR

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 颗粒细胞中时钟基因的表达结果

3．2 LH对颗粒细胞时钟基因表达的影响

3．3 cAMP、p38MAPK和ERK1／2通路的作用

3．4 LH对VLDLr表达的影响

3．5 cAMP对LH调控时钟基因表达节律的作用

3．6 p38MAPK和ERK1／2在LH诱导时钟基因表达的作用

4 讨论

4．1 对颗粒细胞自主节律分析

4．2 LH激素对颗粒细胞时钟基因的作用

4．3 颗粒细胞生物节律衰减分析

4．4 cAMP、p38MAPK和ERK1／2信号通路作用

4．5 卵黄形成对排卵的影响

4．6 cAMP通路对时钟基因生物节律的影响

4．7 p38MAPK和ERK1／2通路对时钟基因表达的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间参加的科研工作和发表论文等