鸭源多杀性巴氏杆菌油乳剂灭活疫苗的制备与应用

摘要

本研究选取分离自某发病鸭场的菌株，经过细菌分离鉴定为鸭源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM），并用此菌株作为制苗菌株，用甲醛灭活后与矿物油佐剂高速乳化混匀，制备鸭源多杀性巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗。通过对试制疫苗的物理性状、疫苗的无菌检测，疫苗的安全性检测，对同源毒株的攻毒保护性试验，采用间接酶联免疫吸附实验(Enzye Linked Immunosorbent Assay，ELISA)对试验鸭和养殖场鸭产生的特异性抗体水平消长规律进行检测，完成对该疫苗的安全性、免疫效力等评估。
　　1.细菌的分离鉴定:本研究菌株选取于某发病鸭场，挑取病料的心血，肝脏，接种于血琼脂平板培养基中培养，通过细菌生物学培养特性、API20NE生化试纸条和16s rRNA基因PCR鉴定结果表明该菌株为多杀性巴氏杆菌;Bioiog全自动微生物鉴定系统鉴定结果表明分离菌株为多杀性巴氏杆菌多杀亚型;PCR荚膜分子分型鉴定结果为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。
　　2.疫苗的物理性状及无菌检测:疫苗的物理性状通过从疫苗的外观，剂型，黏稠度，稳定性四个方面来检验，结果显示该疫苗符合油佐剂疫苗制备的基本标准。然后将制作好的疫苗取少量于血琼脂平板、TSA平板，每次接种0.2mL，观察24～72h有无细菌成长，结果表明72h内培养基上无细菌生长，证明该疫苗无菌检测合格。
　　3.疫苗安全性检测:该疫苗经过物理性质检测及无菌检测合格后，对30日龄健康鸭肌肉注射1 mL/只，观察7d，结果表明免疫试验鸭后未出现任何不良反应，试验鸭成长良好。
　　4.攻毒保护试验:油剂疫苗经过无菌及安全检测合格后，对30日龄试验鸭肌肉注射1mL/只。于免疫后14d，28d进行攻毒保护试验，多杀性巴氏杆菌攻毒菌量为4.5×108CFU/mL。结果表明试验鸭免疫后14d对同源PM强毒的保护率为80％，试验鸭免疫后28d对同源强毒株的保护率为100％。
　　5.间接ELISA检测抗体水平消长:采用鸭源多杀性巴氏杆菌的全菌超声波裂解抗原为包被抗原，用方阵法确定了多杀性巴氏杆菌抗原的最佳包被浓度和HRP-羊抗鸭IgG的最佳浓度，分别为1.1μg/mL、0.33μg/mL。油剂疫苗经过无菌和安全性检测合格后，对6只30日龄健康鸭肌肉注射1 ml/只。于试验鸭免疫后0d，3d，6d，9d，12d,15d,21d,28d,35d,42d,49d,56d,63d,70d,77d,84d,91d,98d,104d测定血清抗体效价。结果表明6d左右可检测出抗体的存在，随着时间的推移，试验鸭的抗体水平逐步升高，在免疫后的28d达到最高值，之后抗体水平逐渐下降，到免疫后的91d仍然维持较高的抗体水平，而且在91d的抗体水平强于12d的免疫水平，至免疫104d后仍能检测出抗体的存在。
　　6.疫苗的实践应用:试制疫苗经实验室检测安全有效，符合制苗生产的基本要求后，将制备好的疫苗大量接种于某鸭场30日龄的成年鸭，用于生产推广应用，观察临床效果，并采血清样本送回实验室检测其抗体水平。结果表明该鸭场免疫疫苗后该病的发生明显减少，免疫鸭产生的抗体水平较高，并且能维持较长时间。说明该疫苗应用该鸭场后能够有效的控制该疾病的流行。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．前言

1．1 多杀性巴氏杆菌的病原学

1．2 多杀性巴氏杆菌分型的研究

1．3 鸭源多杀性巴氏杆菌的免疫机理研究

1．4 禽多杀性巴氏杆菌疫苗的研究进展

1．5 ELISA在检测疫苗免疫抗体的应用

1．6 本实验研究的目的意义

第二章 鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

1．试验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

1．3 培养基的配制

2．试验方法

2．1 细菌的分离培养

2．2 细菌生长曲线的测定

2．3 生化试验鉴定

2．4 16s rDNA鉴定

2．5 PCR荚膜分型

3．结果

3．1 培养特性

3．2 生长曲线图

3．3 镜检结果

3．4 生化试验结果

3．5 16s rRNA PCR结果

3．6 PCR荚膜分型结果

4．讨论

第三章 鸭多杀性巴氏杆菌的油佐剂疫苗的制备与应用

1．试验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂配制

2．试验方法

2．1 毒力的测定

2．2 疫苗的制作

2．3 疫苗物理性状检测

2．4 疫苗的安全性检测

2．5 动物攻毒保护试验

2．6 抗体消长规律检测

2．7 疫苗的生产应用

3．结果

3．1 疫苗的研制

3．2 细菌毒力检测结果

3．3 攻毒保护试验结果

3．4 死亡鸭的临床症状与解剖结果

3．5 细菌再分离鉴定

3．6 抗体消长规律检测结果

3．7 疫苗的生产应用

4．讨论

4．1 疫苗的规范性

4．2 疫苗的佐剂与安全性

4．2 禽多杀性巴氏杆菌油佐剂疫苗的免疫效力

4．3 抗体消长规律的研究

4．4 疫苗的生产应用

结论

参考文献

致谢