鹅BMP4基因克隆及其对颗粒细胞凋亡的抑制作用研究

摘要

BMP4是BMPs蛋白家族中的一员，对卵泡颗粒细胞与膜细胞类固醇激素的分泌以及颗粒细胞分化有着调节作用，并且在有些物种上对颗粒细胞的增殖或凋亡也产生影响。而颗粒细胞的增殖与凋亡对卵泡发育来说至关重要。因此，本试验拟探究BMP4对鹅等级前卵泡颗粒细胞增殖或凋亡的影响。通过基因克隆获得鹅的BMP4基因完整CDS区序列，并采用实时荧光定量技术检测其在不同发育阶段卵泡的颗粒细胞与膜细胞中的相对表达量。通过构建其真核表达载体pEGFP-N1-BMP4，使用脂质体转染法对颗粒细胞进行转染来探究BMP4对鹅颗粒细胞增殖与凋亡的影响。取得的主要研究结果如下:
　　(1)鹅BMP4基因CDS区序列全长为1212bp，其核苷酸序列与斑胸草雀的同源性高达96.3％，编码的氨基酸序列同源性为98.3％。
　　(2)鹅BMP4基因mRNA在颗粒细胞中的相对表达量均高于其在相同卵泡发育阶段的膜细胞中的表达量（卵泡直径为6～8mm的发育阶段除外）。BMP基因mRNA在小卵泡颗粒细胞中表达量较低，随后表达量逐渐上升，于直径8～10mm的卵泡及F5中表达量达到最高，随后又开始迅速下降。膜细胞BMP4基因mRNA表达量在直径6～8mm的卵泡中最高，且这一卵泡发育阶段中BMP4基因mRNA在膜细胞表达量要高于颗粒细胞，而在卵泡其他发育阶段中膜细胞BMP4 mRNA表达量均低于颗粒细胞。
　　(3)颗粒细胞转染36h后，BMP4转染转染组OD值显著高于对照组(P＜0.05)，其他组无显著性差异。说明在转染BMP4基因36h后颗粒细胞活细胞数目高于对照组。
　　(4)颗粒细胞转染36h后，转染组颗粒细胞增殖数目与对照组相比差异不显著，而颗粒细胞凋亡数目相较对照组下降(P＜0.05)。
　　(5)实时荧光定量法检测转染组与对照组颗粒细胞的凋亡相关基因BCL2、caspase-3 mRNA表达量变化，转染组与对照组相比caspase-3基因表达量显著降低(P＜0.05)。

目录

声明

摘要

主要符号说明

1 文献综述

1．1 BMPs简介

1．1．1 BMPs成员

1．1．2 BMPs信号通路

1．1．3 BMPs在卵泡生长发育中的作用

1．2 BMP4与卵泡生长发育

1．2．1 BMP4对卵泡生长发育的影响

1．2．2 BMP4对颗粒细胞凋亡的影响

1．3 研究目的及意义

2 材料与试剂

2．1 试验材料

2．2 试验器材、试剂及使用软件

2．2．1 主要仪器设备

2．2．2 试剂

2．2．3 应用的生物学软件

2．3 试验方法

2．3．1 BMP4序列扩增

2．3．2 BMP4在颗粒细胞与膜细胞的相对表达

2．3．3 BMP4基因转染载体构建

2．3．4 等级前卯泡颗粒细胞培养

2．3．5 BMP4基因转染等级前卵泡颗粒细胞

2．3．6 CCK法检测转染后颗粒细胞数目变化

2．3．7 BrdU检测转染后颗粒细胞增殖

2．3．8 TUNEL检测转染后颗粒细胞凋亡

2．3．9 转染后BCL2、caspase-3基因mRNA水平检测

3 结果与分析

3．1 鹅卯巢总RNA提取结果

3．2 鹅BMP4基因CDS区克隆

3．3 鹅BMP4基因生物信息学预测

3．3．1 BMP4基因CDS区序列变异

3．3．2 不同物种BMP4基因进化树

3．3．3 鹅BMP4氨基酸水平相关预测

3．4 BMP4在鹅卵泡颗粒细胞与膜细胞的表达特性

3．5 转染载体构建结果

3．6 转染后颗粒细胞活细胞数目变化

3．7 转染BMP4后颗粒细胞增殖与凋亡情况

3．7．1 转染BMP4后颗粒细胞增殖情况

3．7．2 转染BHP4后等颗粒细胞凋亡情况

3．7．3 转染后BCL2、caspase-3基因mRNA水平表达量变化

4 讨论

4．1 BMP4基因序列变异特点

4．2 BMP4氨基酸序列特点

4．3 BMP4基因在颗粒细胞与膜细胞中的发育性表达变化规律

4．4 BMP4基因转染颗粒细胞后对颗粒细胞凋亡的抑制作用

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况