犍为县姜瘟病发生与土壤环境因子的关系研究

摘要

生姜是集药、食、香料兼用植物，在世界范围内广泛种植。四川省犍为县是四川菜姜主产区，种植面积大，种植年限长，复种指数高，导致姜瘟病发病严重，制约着犍为县生姜产业的发展。系统研究影响姜瘟病发生的土壤环境因子包括土壤温湿度和理化性质，以及生姜种植地土壤微生物群落变化，可为生姜健康种植提供理论支撑。本次研究在2012-2013年间，采用大棚和常规处理，在保持施肥水平和其他管理措施一致的前提下，系统研究了土壤环境因子与姜瘟病发生的关系;并采用454焦磷酸测序技术对发病和健康生姜根际与非根际土壤的细菌群落变化进行了分析;对发病生姜根际土壤细菌SCAU611T进行了分类和鉴定。
　　1.2012-2013年的田间试验结果表明，土壤含水量与发病率呈显著或极显著正相关，相关曲线为y=1.3223x+28.717(R2=0.523，P＜0.05)（2012年），y=2.0726x+27.269;（R2=0.685，P＜0.01）（2013年）;土壤温度与发病率呈正相关，相关曲线为y=0.6275x+24.756，(R2=0.789，P＜0.01)（2012年），y=0.0652x+27.661，R2=0.06（2013年）。土壤速效磷含量与发病率呈显著正相关，而速效氮含量呈极显著负相关。多元线性回归和PCA分析表明，发病率与土壤含水量、温度、速效磷和速效钾含量关系密切，回归模型中土壤温度和含水量对发病率的解释度为53-65％，为主要因素;土壤速效磷和速效氮的解释度为34-46％，为次要因素。初步的研究结果证实，犍为县姜瘟病发生的土壤含水量临界值为25％。
　　2.454焦磷酸测序结果表明，在门、纲、目、科和属等分类水平上，发病与健康生姜根际和非根际土壤的细菌类群存在明显的不同。以门和属为例，其细菌种群变化特点如下:
　　在门水平，与健康生姜非根际与根际土相比，发病生姜非根际与根际土壤中变形杆菌门（Proteobacteria）所占比例分别下降2.1％和7.2％;放线菌门(Actinobacteria)丰度分别下降0.6％和3.5％;绿弯菌门（Chloroflexi）丰度分别降低2.4％和1.1％，而酸杆菌门(Acidobacteria)比例分别增加2.1％和8.4％。
　　在属水平，罗尔斯通氏属（Ralstonia）的丰度在发病和健康生姜植株根际土壤中均较高，分别为0.44％和0.47％;假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、伯克氏菌属(Burkholderia)、孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属（Rhizobium）和节杆菌属（Arthrobacter）等已被证明具有生防和促生作用的有益菌属的丰度在发病生姜根际土壤中显著降低。上述结果表明，生姜根际土细菌群落变化，特别是有益和生防细菌数量降低是姜瘟病致病菌侵染生姜病发病的诱因。
　　发病和健康生姜根际与非根际土土壤理化指标与门分类单元上各样品门分布的CCA分析表明，土壤的pH、速效磷(AP)和含水量(Moisture)对于细菌群落结构变化存在显著的影响，其中土壤pH变化影响最大。生姜种植土壤pH降低，速效磷含量和含水量升高，改变了土壤细菌群落结构，是影响姜瘟病发生的土壤环境因子。
　　3.对分离自发病生姜根际土的SCAU611的菌株进行鉴定。结果表明，SCAU611为G-，好氧，短杆状，宽0.7-0.9μm，长1.5-3.0μm，极生多鞭毛，具有运动性。SCAU611在LB培养基上，菌落圆形，半透明，淡黄色，表明光滑湿润，在KB培养基上产生绿色荧光色素，生长温度范围为-1-37℃，最适生长温度为30℃，生长的pH范围为pH4.5-9.5，生长的NaCI浓度为0-6％。SCAU611氧化酶、过氧化氢酶和精氨酸双水解酶为阳性，硝酸还原为阴性，并可水解Tween-80和七叶灵，液化明胶和利用D-葡萄糖，D-甘露醇和肌醇等产酸。SCU611DNA G+C含量为65.2％，主要的脂肪酸为C10∶0(3-OH)，C12∶0(2-OH)，C12∶0(3-OH)，C16∶0,C17∶0 cyc,Summed feature3(C16∶1□7c/C16∶1□6c)和Summed feature8(C1s∶1□7c)。 SCAU611与其相关菌Pseudomonas chlororaphis DSM21509T(98.3％)和P.psychrophila JCM10889T(98.1％)的DNA-DNA杂交率分别为42.85％和43.92％，且SCAU611与P.chlororaphis DSM21509T和P.psychrophila JCM10889T的已知特征存在差异，SCAU611可在37℃下很好的生长;可水解Tween80和七叶灵;可利用D-山梨醇做唯一碳源生长;并可发酵肌醇产酸。而两株参考菌株则不能。因而将SCAU611菌株定为Pseudomonas属的一个新种，并命名为乐山假单胞菌(Pseudomonas leshanense sp.nov.)，SCAU611T为代表菌株。

目录

论文说明

声明

摘要

1 引言

2 文献综述

2．1 土壤理化指标与植物土传病害发生的研究

2．1．1 土壤温度

2．1．2 土壤质地

2．1．3 土壤含水量

2．1．4 土壤养分

2．2 土壤微生物对植物土传病害影响的研究

2．2．1 竞争作用

2．2．2 拮抗作用

2．2．3 微生物群落结构对病害的抑制作用

2．3 土壤微生物群落研究技术现状

2．3．1 传统的微生物研究方法

2．3．2 BIOLOG微平板方法

2．3．3 PLFA图谱分析

2．3．4 分子生物学方法

2．4 本研究的意义

3 土壤理化特性对姜瘟病发病的影响研究

3．1 研究区概况

3．2 研究方法

3．2．1 试验设计

3．2．2 土壤含水量、温度和发病率监测

3．2．3 土壤理化性质测定

3．2．4 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 土壤含水量、温度对姜瘟病发生的影响

3．3．2 土壤养分含量对姜瘟病发生的影响

3．3．3 多元线性回归分析

3．3．4 主成分(PCA)分析

3．4 讨论

3．4．1 土壤温度和含水量与姜瘟病发生

3．4．2 速效磷和速效氮含量

3．5 小结

4 生姜种植土壤细菌群落454焦磷酸测序

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 引物设计

4．1．3 样本处理

4．1．4 上机测序

4．1．5 CCA分析

4．2 结果与分析

4．2．1 土壤样品含水量和理化性质

4．2．2 454测序数据预处理及有效数据统计

4．2．3 操作分类单元(OTU)分类及Alpha评估

4．2．4 在门(Phylum)分类水平上细菌类群分布

4．2．5 在纲(class)分类水平细菌类群变化

4．2．6 在目(order)分类水平细菌类群变化

4．2．7 在科(family)分类水平上细菌类群变化

4．2．8 在属(Genus)分类水平细菌类群变化

4．2．9 CCA分析

4．3 讨论

4．3．1 生姜非根际与根际土壤细菌群落变化

4．3．2 土壤环境因子对细菌群落变化的影响

4．4 小结

5．乐山假单胞菌的分离鉴定

5．1 材料与方法

5．1．1 供试菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 表型特征分析

5．1．4 脂肪酸分析

5．1．5 16S rDNA序列分析

5．1．6 DNA-DNA杂交

5．2 结果与分析

5．2．1 形态学特征

5．2．2 生理生化特征

5．2．3 脂肪酸分析

5．2．4 菌株的分子鉴定及系统发育树构建

5．2．5 DNA-DNA杂交

5．3 结论与讨论

5．4 乐山假单胞菌(Pseudomonas leshanense)的描述

6．全文结论与研究建议

6．1 全文结论

6．2 研究建议

参考文献

致谢

附录：各分类单元详细丰度列表

攻读学位期间所获得科研成果