基于转录组数据对三系杂交水稻低结实率原因初探

摘要

水稻作为全世界的主要粮食作物之一，在世界粮食安全中具有举足轻重的作用。三系杂交稻的推广和应用为我国乃至世界的粮食生产作出了巨大贡献。但是，随着城市化进程加快，耕地面积逐年减少，农村劳动力向城市转移，而同时，我国人口数量却在不断增长，粮食需求不断增加，我国粮食安全受到越来越大的挑战。进一步挖掘杂交水稻产量潜力，提高水稻单产能力，确保水稻总产稳步提高，从而保证我国的粮食安全，是育种工作者面临的首要任务。
　　结实率是水稻产量构成的重要因素之一，在三系杂交水稻生产中表现尤为突出。正常情况下，三系杂交水稻组合的结实率一般只有80％左右，而常规水稻品种和两系杂交稻品种的结实率都比杂交水稻高，且二者差异明显。同时也预示出三系杂交稻产量还有巨大的提升空间，如果能将其结实率同样提高到常规稻结实率，将为三系杂交稻的产量水平带来一个质的飞跃。因此，开展三系杂交稻结实率相关遗传研究，揭示三系杂交稻结实率遗传控制机理，从而实现有效的人工改良和控制，达到显著提高三系杂交稻的结实率水平，进而提高三系杂交稻产量水平的目的，具有十分重要的意义。随着生物技术的飞速发展，涌现出大量以基因组测序、转录组测序等为代表的遗传研究新兴技术和手段，为我们开展结实率相关研究提供了新的途径和突破口。
　　本实验室前期选育出一个三系不育系G80A，在常年的组配中发现其与任何恢复系组配的结实率始终在60％左右，并受高温条件的严重影响，是研究三系杂交水稻低结实率的一个极端表型材料。本研究利用G80A、G80B分别和蜀恢527做杂交F1为研究对象，在常温和高温处理条件下，通过对孕穗期幼穗进行转录组测序、表达差异分析和生物信息学分析，筛选结实率相关控制基因。并将获得的目标基因在杂交组合G80A/蜀恢527、G80B/蜀恢527、Ⅱ-32A/蜀恢527、Ⅱ-32B/蜀恢527、G46A/蜀恢527和G46B/蜀恢527上进行了Q-PCR验证。获得初步结果如下:
　　1、花粉育性检测结果表明:在常温处理条件下，所有杂交稻组合花粉染色都是正常的。可以排除因为恢复力不够导致花粉育性不过关，而引起结实率下降。
　　2、常温处理下，G80A/蜀恢527的结实率为62％，Ⅱ-32A/蜀恢527和G46A/蜀恢527的结实率分别为80％和78％。G80B/蜀恢527的结实率为93％，Ⅱ-32B/蜀恢527和G46B/蜀恢527的结实率分别为90％和93％。说明三系不育胞质的存在会导致三系杂交稻结实率降低。
　　3、高温处理下G80A/蜀恢S27的结实率为31％，Ⅱ-32A/蜀恢527和G46A/蜀恢527的结实率分别为42％和45％。G80B/蜀恢527的结实率为56％，Ⅱ-32B/蜀恢527和G46B/蜀恢527的结实率分别为65％和66％。说明高温影响水稻结实率，而三系杂交稻结实率受高温影响更明显。
　　4、通过转录组测序、差异基因比对筛选和Q-PCR验证，获得影响三系杂交水稻结实率的可能的差异基因6个。分别是:LOC_Os02g52780、LOC_Os03g60080、LOC_Os05g38290、LOC_Os05g41780、LOC_Os08g43700、LOC_Os12g02980，这些基因在三系杂交水稻幼穗中的表达量都显著低于正常水稻幼穗。
　　5、通过差异分析筛分别选出常温和高温下G80A/蜀恢527的差异基因以及G80B/蜀恢527的差异基因，再通过比对获得后者与前者相异的基因，并将这些基因与高温下G80A/蜀恢527和G80B/蜀恢527的差异基因相对比，找出其中相同的差异基因，再将这些基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，找到了22个可能与三系杂交水稻在高温下的结实率降低过快相关的基因。
　　综上所述，本研究利用一份三系杂交稻低结实率极端材料，通过转录组测序、差异基因比对筛选、Q-PCR验证、GO富集分析和KEGG通路分析等分析，获得6个可能与三系杂交水稻低结实率相关的基因和22个可能与三系杂交水稻在高温下的结实率降低过快相关的基因。通过进一步确认和解析这些基因的功能，将有助于解析三系杂交稻结实率控制的遗传机理，并为三系杂交稻结实率的分子改良奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 水稻结实率研究进展

1．2 高温对水稻结实率的影响

1．2．1 花粉不育

1．2．2 花药开裂出现问题，花粉量不足

1．2．3 花粉活力不足，萌发能力降低

1．3 转录组和转录组测序概念解析

1．4 转录组测序技术进展

1．4．1 第一代测序技术

1．4．2 第二代测序技术(高通量测序技术)

1．4．3 第三代测序技术

1．4．4 三代测序技术比较

1．5 选题依据及研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 生化试剂和耗材

2．1．3 转录组测序公司

2．1．4 仪器设备

2．2 实验材料的准备

2．3 花粉育性检测和结实率统计

2．4 转录组测序技术路线

2．5 转录组数据质量检测

2．5．1 测序错误率检测

2．5．2 GC含量的检测

2．5．3 原始数据组成

2．5．4 表达水平饱和曲线检测

2．5．5 RNA-seq相关性检测

2．6 差异基因的筛选

2．6．1 影响三系水稻结实率的差异基因的筛选

2．6．2 导致三系杂交水稻高温敏感的差异基因的筛选

2．7 差异基因的G0富集和KEGG代谢通路分析

2．8 差异基因的实时荧光定量PCR验证

2．8．1 定量引物的设计和筛选

2．8．2 qPCR验证

第三章 结果与分析

3．1 各组合常温下花粉育性检查

3．2 各组合的结实率

3．3 RNA的提取和检测

3．4 转录组数据质量检测结果

3．4．1 GC含量分布图分析结果

3．4．2 基因表达水平饱和曲线

3．4．3 RNA-seq相关性

3．5 差异基因筛选结果

3．5．1 各组合差异基因分析

3．5．2 引起三系杂交水稻结实率较低的差异基因的选择

3．5．3 影响三系杂交水稻结实率差异基因的qPCR验证结果

3．5．4 引起三系杂交水稻高温条件下结实率降低过快基因的筛选

第四章 讨论及后续研究设想

4．1 讨论

4．1．1 转录组测序是快速获得表型相关基因的有效手段

4．1．2 三系不育胞质可能通过影响细胞核基因表达来调控三系杂交稻结实率

4．1．3 三系杂交稻对高温更敏感

4．2 试验小结与后续研究设想

4．2．1 试验小结

4．2．2 后续研究设想

参考文献

致谢