玉米孤雌生殖单倍体胚遗传转化体系建立的初步研究

摘要

本研究将玉米孤雌生殖单倍体胚作为外植体，在二倍体胚的遗传再生与转化条件的基础上对部分条件进行优化，成功摸索出单倍体幼胚培养中的倍性鉴定方法，成功获得了单倍体再生植株和转基因阳性植株，初步建立了孤雌生殖单倍体幼胚遗传再生体系和转化体系;与此同时，利用单倍体成熟胚作为受体进行遗传转化，不经成熟胚较为困难的脱分化过程而直接再生为单倍体植株。本研究探索了一套新的转基因方法，为单倍体育种的应用提供了一个新的可能和方向。同时，本研究还对转基因过程中单倍体、二倍体与杂合体之间的亚细胞结构差异进行了比较分析，为单倍体遗传转化体系的建立提供了一定的理论支持。具体地，本研究得到如下结果:
　　(1)本实验以玉米孤雌生殖诱导系EDI为父本，18-599R为母本杂交诱导单倍体，利用诱导系标记基因的特性对幼胚诱导后的愈伤组织进行光照条件的筛选，发现杂合个体的愈伤组织呈现出紫色，而单倍体个体的愈伤组织仍为黄色，且光照方式对筛选单倍体个体的效果不显著，而光照时间间的差异达到了极显著水平，其中20 h、40 h下可成功分离筛选出单倍体愈伤组织。但由于40 h水平下，愈伤组织出现了变绿，由朝分化方向发展的趋势，不利于后期实验的培养，因此最终确定单倍体愈伤组织初步筛选的光照条件为光照培养20 h，光照强度2000lx。
　　(2)由于光照筛选不能完全将非单倍体剔除，标记基因的显现与植株组织的基因型及成熟度有关，因此我们还需进一步准确地确定出单倍体个体，本实验利用经光照筛选后再通过染色体压片筛选、流式细胞检测筛选这样一套单倍体鉴定的方法，最终从3000颗幼胚中获得110份单倍体材料，单倍体率为3.67％，与诱导系EDI的诱导率(3.5％)相近，从而实现对材料一致性的保证。
　　(3)本实验通过对分化过程中的激素配比进行正交设计优化，我们发现处理(KT(0.5 mg/L)+6-BA(0.5 mg/L)+ABA(0.5 mg/L)+2,4-D(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L))的单倍体成苗率显著高于其他组合，且对不同因素的不同处理浓度进行分析，结果均不显著。因此，对其中的不显著因素须将不同因素的水平梯度设定范围加大，从而筛选出主要因素的最佳水平。
　　(4)本实验通过对18-599R单倍体幼胚诱导的愈伤组织进行再生和转化，成功地获得了13株再生单倍体植株、15株再生双单倍体植株及4个单倍体阳性个体。本实验利用授粉12-14 d左右的HiⅡ单倍体成熟胚进行转化，转化后直接再生成为植株，跳过了成熟胚困难的愈伤组织诱导及培养阶段，最终得到14个单倍体阳性个体。
　　(5)本实验通过对单倍体、二倍体及杂合体愈伤组织的亚细胞结构进行观察分析得到以下结果:细胞壁平均厚度:单倍体＞二倍体＞杂合体;而愈伤组织的细胞核大小差异较大;单倍体在观察视野中普遍存在较多的线粒体。因此，本实验推测较厚的细胞壁可能一方面可以保护脆弱的单倍体细胞，而另一方面这也为优化单倍体遗传转化的条件提供了一定的理论依据，农杆菌侵染的浓度和时间等都将随之发生改变。较多的线粒体可能是因为单倍体较弱的生活力下更需要保证其较强的呼吸作用，以适应和抵抗外界环境对其生存的影响。

目录

声明

摘要

一、研究背景

1 玉米单倍体育种的研究进展

1．1 孤雌生殖单倍体产生的遗传和生物学机制

1．2 植物单倍体加倍机制

1．3 玉米单倍体应用前景展望

2 玉米单倍体转基因育种研究前景

2．1 单倍体转基因受体的选择

2．2 单倍体转基因受体系统建立的影响因素

2．3 玉米单倍体转基因育种前景展望

3 研究的目的意义

二、材料与方法

1 实验材料

1．1 供试玉米材料

1．2 培养基及重要试剂配方

1．3 分子实验材料与试剂

1．4 主要仪器与设备

2 实验方法

2．1 技术路线

2．2 实验方法

三、结果与分析

1 18-599R x EDI单倍体幼胚遗传再生体系的建立

1．1 幼胚诱导愈伤组织情况

1．2 愈伤组织倍性的鉴定

1．3 分化条件优化结果

1．4 单倍体植株的统计、双单倍体材料的获得与杂合体种子的加代

1．5 单倍体幼胚遗传再生过程中的异常现象

2 18-599R x EDI单倍体幼胚遗传转化体系的建立

3 Hi Ⅱ x EDI单倍体成熟胚遗传转化体系的建立

4 不同倍性玉米愈伤组织亚细胞结构差异分析

四、讨论与结论

1 讨论

1．1 单倍体诱导亲本材料的选择

1．2 单倍体转基因受体材料的选择

1．3 单倍体材料鉴定方法的选择

1．4 影响单倍体遗传转化效率的重要阶段

1．5 自然加倍对单倍体遗传转化的影响

1．6 单倍体自身细胞结构的差异对遗传转化影响

1．7 单倍体幼胚遗传转化体系的改进

2 结论

3 小结

参考文献

致谢

附录