玉米MYB111和MYB148转录因子调控苯丙烷代谢途径的初步研究

摘要

MYB转录因子是植物基因组内数量庞大、功能多样化的转录因子家族之一，广泛地参与植物体的苯丙烷类物质代谢调控、细胞形态建成调控、细胞周期循环调控以及对逆境胁迫做出应答等生理活动，在植物生长发育和抵御逆境的过程中发挥着不可替代的作用。苯丙烷代谢是植物体一条非常重要的次生代谢途径，所有包含苯丙烷骨架的化合物都是通过这条代谢途径生成的。苯丙烷类物质代谢出现在维管植物发生分离之前，单子叶植物与双子叶植物之间某些苯丙烷类衍生物的代谢具有进化上的保守性。苯丙烷类衍生物在植物抵御微生物入侵、环境胁迫等过程中发挥重要作用;木质素作为保护植物细胞壁的天然屏障，赋予细胞壁机械强度和硬度的同时为植物提供疏水的维管系统，参与植物抵御真菌性病害胁迫的过程、增强植物抗倒伏及抗旱能力;花青素可清除植物体内因逆境胁迫而积累的活性氧及自由基，保护植物免受因逆境胁迫而造成的氧化性损伤;原花青素积累在种子的种皮中，能加固种皮、诱导种子进行冬眠、防御病原菌胁迫，保护种子不受物理及生物伤害;黄酮醇能够吸收紫外光，发挥“紫外光过滤器”的作用，防止植物体及光合作用器官受到紫外光的辐射等。
　　玉米是我国第一大作物，深入研究玉米苯丙烷代谢途径对于通过分子手段选育高抗、优质玉米品种具有重要意义，但是玉米中苯丙烷代谢途径的研究远滞后于双子叶植物。拟南芥等双子叶植物中的R2R3MYB转录因子广泛的参与类黄酮、木质素等苯丙烷类衍生物的调控，为玉米中苯丙烷代谢调控的研究提供重要信息。同时本课题组前期对玉米基因组中158个R2R3MYB转录因子的分布规律及进化机制进行了研究，并通过同源性分析、共表达分析、线性分析等方法筛选到苯丙烷代谢途径中高度保守的R2R3MYB转录因子基因，可能参与苯丙烷类衍生物代谢的调控。本研究以玉米优良自交系B73为材料，从中克隆到两个R2R3MYB转录因子ZmMYB111和ZmMYB148，并对其功能进行了初步研究;研究结果表明，ZmMYB111和ZmMYB148可能通过激活苯丙烷代谢途径限速酶PAL的活性来调控玉米中苯丙烷类衍生物的合成，但是具体影响到哪一种苯丙烷类衍生物还需进一步研究。本研究具体结果如下:
　　1、克隆ZmMYB111和ZmMYB148基因，得到了完整的开放阅读框。对ZmMYB111和ZmMYB148蛋白的高级结构预测分析，结果表明ZmMYB111和ZmMYB148具有典型的R2R3MYB蛋白的二级结构、三级结构及结构域。将ZmMYB111和ZmMYB148与拟南芥等植物中调控苯丙烷代谢的R2R3MYB转录因子构建亲缘进化树(NJ树)并对其保守基序进行分析，结果表明ZmMYB111和ZmMYB148与其他调控苯丙烷代谢的R2R3MYB有较近的亲缘关系并含有保守的基序。
　　2、实时定量PCR分析ZmMYB111和ZmMYB148在不同组织中的表达情况。结果表明ZmMYB111在苗期叶片、茎秆的髓部、雌花中几乎不表达，在成熟期叶、苗期根、雄花中表达量较低，在成熟期根、胚乳、成熟种子中表达量中等，茎杆上部表达量较高，茎秆下部表达量最高;ZmMYB148在苗期叶片、茎秆的髓部、雌花中几乎不表达，在成熟期叶、雄花中表达量较低，在苗期根、茎杆上部、成熟种子中表达量中等，在成熟期根、茎秆下部表达量较高，玉米胚乳中表达量最高。
　　3、利用酵母转化实验分析ZmMYB111和ZmMYB148是否具有转录激活活性。结果显示PGBDKT7-111和PGBDKT7-148可以在SD/-Trp/-His/3-AT/X-α-gal的缺陷型培养基上生长，说明ZmMYB111和ZmMYB148都具有转录激活活性。
　　4、基因枪轰击洋葱表皮细胞对ZmMYB111和ZmMYB148蛋白亚细胞定位。结果表明ZmMYB148定位在细胞核中，可能在转录水平调控基因的表达;ZmMYB111主要定位在细胞核中，但是细胞膜上也有少量荧光，说明ZmMYB111可能除了在转录水平调控基因的表达之外，也许还参与细胞膜的保护或者膜蛋白的转运等过程。
　　5、克隆苯丙烷代谢途径中关键酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸COA连接酶(4CL)的启动子pPAL、p4CL，利用酵母单杂交实验验证克隆的转录因子与pPAL、p4CL在玉米体外是否可以结合。结果表明ZmMYB111和ZmMYB148可以与pPAL、p4CL结合，而且ZmMYB148与pPAL、p4CL结合能力比ZmMYB111与pPAL、p4CL结合能力强。
　　6、PAL是苯丙烷代谢途径的限速酶，为了进一步验证ZmMYB111和ZmMYB148与pPAL的结合及对pPAL活性的影响（激活或抑制），利用基因枪轰击玉米胚乳细胞进行瞬时表达实验。结果表明ZmMYB111和ZmMYB148在玉米胚乳中可以与pPAL结合，增加pPAL的活性;并且ZmMYB148对pPAL的激活作用比ZmMYB111强，该结果与酵母单杂交实验结果一致。

目录

声明

摘要

缩写表

1 文献综述

1．1 MYB转录因子的研究进展

1．1．1 MYB转录因子的特征及分类

1．1．2 MYB转录因子的功能及调控机制

1．2 苯丙烷类物质代谢的研究进展

1．2．1 苯丙烷类物质代谢的起源

1．2．2 苯丙烷类衍生物在植物体内的合成途径

1．2．3 苯丙烷类衍生物在植物体内的重要作用

1．3 MYB转录因子对苯丙烷类物质代谢的调控

1．3．1 MYB转录因子对木质素代谢的调控

1．3．2 MYB转录因子对类黄酮代谢的调控

1．4 本研究的意义及主要内容

1．4．1 本研究的意义

1．4．2 本研究的主要内容

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株及载体

2．1．3 酶及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 生物信息学软件

2．2．2 ZmMYB111和ZmMYB148基因的克隆

2．2．3 ZmMYB111和ZmMYB148的组织特异性表达分析

2．2．4 ZmMYB111和ZmMYB148转录激活活性分析

2．2．5 ZmMYB111和ZmMYB148的亚细胞定位

2．2．6 苯丙烷代谢途径关键酶基因启动子的克隆

2．2．7 酵母单杂交实验

2．2．8 瞬时表达实验

3 实验结果与分析

3．1 MYB转录因子的克隆及生物信息学分析

3．1．1 ZmMYB111和ZmMYB148基因的克隆

3．1．2 ZmMYB111和ZmMYB148的序列及蛋白结构分析

3．1．3 Zm MYB111和ZmMYB148的系统进化树构建及保守基序分析

3．2 ZmMYB111和ZmMYB148的组织特异性表达分析

3．2．1 RNA提取结果

3．2．2 标准曲线的建立

3．2．3 ZmMYB111和ZmMYB148在不同组织中表达情况

3．3 ZmMYB111和ZmMYB148的转录激活活性分析

3．4 ZmMYB111和ZmMYB148的亚细胞定位

3．5 苯丙烷代谢途径中关键酶基因启动子的克隆

3．6 酵母单杂交实验

3．7 瞬时表达实验

3．7．1 苯丙氨酸解氨酶PAL的组织特异性表达

3．7．2 苯丙氨酸解氨酶PAL启动子体外活性检测

3．7．3 瞬时表达实验

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．1．1 ZmMYB111和ZmMYB148具有R2R3MYB转录因子的基本特征

4．1．2 ZmMYB111和ZmMYB148可能参与苯丙烷代谢的调控

4．1．3 瞬时表达实验方法及受体材料的选择

4．2 结论

参考文献

附录

致谢

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