酸解氧化魔芋葡甘露聚糖免疫及脂质代谢调节机理研究

摘要

本研究采用氧化酸解法成功制备了氧化魔芋葡甘露聚糖(OKGM)及其酸解产物(A-OKGM)，并对二者进行了特性分析;选取450尾鱼，进行为期60天的饲养试验，首先考察了较高剂量(4.0、8.0、16.0、32.0 g/kg)的OKGM对齐口裂腹鱼肠道性能及肠道菌群的影响;进一步再在齐口裂腹鱼饲料中不添加、添加8.0、16.0、32.0 g/kg的OKGM及添加8.0、16.0、32.0 g/kg的A-OKGM，共选取840尾，进行了2批为期60天的饲养试验;通过饲养试验研究了不同水平的OKGM及A-OKGM对齐口裂腹鱼生长性能的影响;通过饲养试验和攻毒试验研究了不同水平的OKGM及A-OKGM对齐口裂腹鱼免疫性能的影响;克隆了齐口裂腹鱼IL-1β、TNF-α和TLR22基因片段，并通过饲养试验考察了不同水平的OKGM及A-OKGM对其头肾、中肾、脾脏和肠道IL-1β、TNF-α和TLR22基因表达的影响;60天饲养试验结束后，对齐口裂腹鱼腹腔注射嗜水气单胞菌，考察感染6h后免疫性能及头肾、中肾、脾脏和肠道中IL-1β、TNF-α和TLR22基因表达情况;克隆了齐口裂腹鱼LPL和FAS基因片段，并通过饲养试验考察了不同水平的OKGM及A-OKGM对齐口裂腹鱼脂肪含量及肝脏和肌肉中LPL和FAS基因表达的影响。研究结果如下:
　　1.HCl酸解法显著降低了OKGM的特性粘度，OKGM和A-OKGM的特性粘度分别为822.82 cm3/g和46.55 cm3/g，通过Mark-Houwink公式推算，二者的粘均分子量分别为4.7×105 Da和9.2×103 Da;从扫描电镜结果来看，KGM表面呈鳞片状，有明显的平行条状褶皱，OKGM颗粒表面显得平整致密，而A-OKGM表面粗糙，酸腐蚀现象较为明显。从DSC热特征分析结果表明，经H2O2氧化后的OKGM热稳定性与KGM相差不大，而经HCl酸解处理得到的A-OKGM，热稳定性明显低于KGM和OKGM;红外光谱分析结果表明，利用盐酸降解氧化魔芋葡甘露聚糖，并不会改变魔芋葡甘露聚糖的主链结构。
　　2.日粮中添加16.0 g kg-1 OKGM会显著提高齐口裂腹鱼前肠黏膜褶皱高度(P＜0.05)，而日粮中添加4.0 g kg-1-32.0g kg-1OKGM会不同程度的提高中肠和后肠黏膜褶皱高度(P＜0.05)。8.0-32.0 g kg-1 OKGM组前肠黏膜上皮高度显著高于对照组(P＜0.05)，在中肠，8.0和16.0 g kg-1OKGM组黏膜上皮高度显著提高(P＜0.05)，在后肠中，各OKGM组的黏膜上皮高度均显著高于对照组(P＜0.05)。从黏膜下层厚度可以看到，在前肠中，OKGM组均显著高于对照组(P＜0.05)，在中肠中，4.0-16.0 g kg-1OKGM组显著高于对照组(P＜0.05)，而后肠中8.0 g kgl和16.0 gkg-1组显著高于对照组(P＜0.05)。第4.0和8.0 g kgl OKGM组前肠和中肠外纵肌层厚度显著高于对照组(P＜0.05)。各OKGM组前肠内环肌层厚度均显著高于对照组(P＜0.05)，4.0和8.0 g kg-1 OKGM中肠内环肌层厚度显著增加(P＜0.05)，此外，第8.0 g kgl OKGM组后肠内环肌层厚度也显著提高(P＜0.05)。与对照组相比，32.0 g kgl OKGM组前肠杯状细胞显著低于对照组(P＜0.05)，而在中肠和后肠，各组与对照组差异不显著(P＞0.05)。从聚类分析可以看出，4.0和8.0 g kg1OKGM组先聚为一类，再和16.0 g kgl OKGM组聚到一类，然后和32.0 g kgl OKGM组聚为一类，最后与对照组聚到一起。对照组肠道菌群多样性指数显著低于OKGM组(P＜0.05)，而其余各组差异不显著(P＞0.05)。
　　3.与对照组相比，在齐口裂腹鱼日粮中添加8.0 g kg-1的A-OKGM显著（P＜0.05）增加了齐口裂腹鱼的增重率、特定生长率和蛋白质效率，显著降低了饵料系数（P＜0.05），其余各组的生长性能指标与对照组差异不显著(P＞0.05)。日粮中添加OKGM和A-OKGM对齐口裂腹鱼头肾指数、中肾指数、脾体指数、肠长指数及肠体指数无显著影响;8.0 g kg-1 A-OKGM组的血清溶菌酶活性显著高于(P＜0.05)对照组，而16.0 g kg-1 A-OKGM组血清溶菌酶活性极显著高于(P＜0.01)对照组，8.0 g kgl OKGM组血清补体C3含量显著高于(P＜0.05)对照组，8.0 g kgl和16.0 g kgl A-OKGM组血清补体C3含量极显著高于(P＜0.01)对照组;第5、6、7组血清IgM含量极显著高于(P＜0.01)对照组;32.0 g kg-1 OKGM组和8.0 g kg-1A-OKGM组血清SOD活性极显著高于(P＜0.01)对照组，8.0 g kgl和16.0 g kglOKGM组和16.0 g kgl A-OKGM组血清SOD活性显著高于(P＜0.05)对照组;各试验组血清MDA含量极显著低于(P＜0.01)对照组;各试验组血清GSH-Px活性差异不显著(P＞0.05);攻毒后第2天后和第10天后，各组成活率差异不显著(P＞0.05)，攻毒第6天后，8.0 g kg-1 A-OKGM组的成活率显著高于(P＜0.05)对照组，攻毒第14天后，8.0 g kg-1 A-OKGM组的成活率极显著高于(P＜0.01)对照组，其中，对照组的成活率最低。
　　4.克隆了齐口裂腹鱼IL-1β、TNF-α及TLR22基因的部分片段，其片段大小分别为120bp、116 bp和174bp，编码39、38和58个氨基酸;32.0 g kg-1 OKGM组及8.0 g kgl、16.0 g kg-1和32.0g kg-1 A-OKGM组脾脏IL-1β表达量显著(P＜0.05)高于对照组，8.0 g kg-1 A-OKGM组头肾IL-1β表达量显著(P＜0.05)高于对照组，8.0 g kgl OKGM组和16.0 g kgl A-OKGM组肠道IL-1β表达量显著(P＜0.05)高于对照组，中肾中各组IL-1β表达量差异不显著(P＞0.05);16.0 g kg-1和32.0g kgl A-OKGM组脾脏TNF-α的表达量显著(P＜0.05)高于对照组，32.0 g kglOKGM组和8.0 g kgl A-OKGM组头肾中TNF-α的表达量显著高于(P＜0.05)对照组，与对照组相比，8.0 g kg-1 OKGM组中肾TNF-α的表达量显著上调(P＜0.05)，其余各组差异不显著(P＞0.05)，肠道中，32.0g kgl A-OKGM组TNF-α的表达量显著高于(P＜0.05)对照组;在脾脏和中肾中，16.0 g kgl A-OKGM组TLR22mRNA的表达量显著高于(P＜0.05)对照组，8.0 g kg-1 A-OKGM组头肾TLR22的表达量显著高于(P＜0.05)对照组，而与对照组相比，各组肠道TLR22表达量差异不显著(P＞0.05)。
　　因此，得出如下结论:
　　1.采用盐酸降解OKGM，不会改变KGM的主链结构，且能显著降低其特性粘度，获得低分子量OKGM，制备方法切实可行。
　　2.日粮中添加4.0-32.0 g kg-1 OKGM能有效改善齐口裂腹鱼的肠道形态，调节肠道菌群，其中，16.0 g kg-1效果最为显著。
　　3.在齐口裂腹鱼日粮中添加8.0 g kg-1-32.0 g kg-1的OKGM或A-OKGM均能不同程度地提高生长性能，增强齐口裂腹鱼的免疫活性和抗氧化性能，提高攻毒后鱼的成活率，其中，8.0 g kg-1 A-OKGM组作用最为显著。
　　4.日粮中添加OKGM和A-OKGM会上调齐口裂腹鱼IL-1β、TNF-α和TLR22基因在头肾、中肾、脾脏和肠道中的表达，其中，8.0 g kg-1和16.0 g kg-1A-OKGM最为显著。
　　5.日粮中添加OKGM和A-OKGM能不同程度的上调感染嗜水气单胞菌齐口裂腹鱼头肾、中肾、脾脏和肠道中IL-1β、TNF-α和TLR22的表达;日粮中添加8.0 g kg-1 A-OKGM能显著增强感染嗜水气单胞菌齐口裂腹鱼血清补体C3含量和溶菌酶活性。
　　6.日粮中添加OKGM和A-OKGM会在一定程度上影响齐口裂腹鱼体脂肪含量;日粮中添加8.0 g kg-1 A-OKGM显著上调了齐口裂腹鱼肝脏LPL基因的表达，但日粮中添加OKGM和A-OKGM对齐口裂腹鱼肝脏和肌肉FAS基因的表达无显著影响。

目录

声明

摘要

缩写表

引言

第一节 文献综述

1．1 多糖与水生动物的关系研究进展

1．1．1 多糖对水生动物生长性能的影响

1．1．2 多糖对水生动物免疫活性的影响

1．1．3 多糖对水生动物脂质代谢的影响

1．1．4 多糖对水生动物抗氧化性的影响

1．1．5 多糖对水生动物肠道性能的影响

1．2 不同分子量多糖的生物活性研究进展

1．3 氧化魔芋葡甘露聚糖研究进展

1．3．1 魔芋葡甘露聚糖概况

1．3．2 魔芋葡甘露聚糖降解产物的生物活性

1．3．3 氧化魔芋葡甘露聚糖研究进展

1．4 鱼类免疫相关基因研究进展

1．4．1 鱼类肿瘤坏死因子-α研究进展

1．4．2 鱼类白细胞介素-1β研究进展

1．4．3 鱼类Toll样受体22研究进展

1．5 鱼类脂质代谢相关基因研究进展

1．5．1 鱼类脂蛋白脂酶研究进展

1．5．2 鱼类脂肪酸合成酶研究进展

1．6 存在的问题

1．7 研究的目的及意义

1．7．1 研究的目的

1．7．2 研究的意义

第二节 氧化魔芋葡甘露聚糖及酸解氧化魔芋葡甘露聚糖的制备及特性研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三节 氧化魔芋葡甘露聚糖对齐口裂腹鱼肠道形态及肠道菌群的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四节 氧化魔芋葡甘露聚糖及酸解氧化魔芋葡甘露聚糖对齐口裂腹鱼生长及免疫性能的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五节 氧化魔芋葡甘露聚糖及酸解氧化魔芋葡甘露聚糖对齐口裂腹鱼IL-1β、TNF-α及TLR22基因表达的影响

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．3 结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六节 氧化魔芋葡甘露聚糖及酸解氧化魔芋葡甘露聚糖对感染嗜水气单胞菌齐口裂腹鱼IL-1β、TNF-α及TLR22基因表达及免疫性能的影响

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．3 结果

6．4 讨论

6．5 小结

第七节 氧化魔芋葡甘露聚糖及酸解氧化魔芋葡甘露聚糖对齐口裂腹鱼脂肪含量及LPL和FAS基因表达的影响

7．1 前言

7．2 材料与方法

7．3 结果

7．4 讨论

7．5 小结

第八节 全文总结、创新点和研究展望

8．1 全文总结

8．2 创新点

8．3 研究展望

参考文献

致谢

附录

博士在读期间发表的论文