三株枯草芽孢杆菌体外降解饲料蛋白的差异及编码蛋白酶基因的分析

摘要

枯草芽孢杆菌是重要的益生菌饲料发酵剂菌种，而不同种动物肠道内枯草芽孢杆菌在降解饲料蛋白能力上的差异及编码降解蛋白酶基因有何特点，是值得深入研究的课题。它有助于我们了解枯草芽孢杆菌在不同动物肠道中的生长活力、蛋白酶活力和酶结构稳定性，这对开发应用于猪、禽和水产养殖的微生物制剂有着重要的意义。
　　本研究选用从本实验室已分离筛选到的三株性状优良且不同来源的枯草芽孢杆菌（分别是鱼源A7株、猪源H6株和鸡源S1株）。通过单因子试验设计优化种子培养基，确定了A7株、H6株和S1株的最佳培养温度是28℃、37℃和39℃，以及最佳培养pH值是pH7.0、pH7.0和pH6.8。
　　采用正交设计对菌株固体发酵培养基进行优化试验，确定了三株菌株的最佳固体发酵条件均为:装料量40g/250ml、接种量5％和固体发酵时间48h。在上述最佳固体发酵条件的基础上制作菌粉，A7株菌粉中活菌数可达8.90×109 CFU/g，H6株可达5.60×1010CFU/g和S1株可达6.80×1010 CFU/g，三种菌粉中芽孢率均在90％左右。菌株保存期内的复活试验结果显示，A7株在保存期内复活效果最好，H6株次之，S1株最差。A7菌株的复活率和芽孢率均较稳定，至保存期3月，A7株菌粉含菌量为6.34×109CFU/g，芽孢含量为5.13×109CFU/g，菌粉中芽孢率仍达到80％以上，芽孢复活率为78.86％，，且菌粉于4℃条件下保存比相同环境常温保存更稳定。
　　菌株降解蛋白能力试验结果显示，A7株＞H6株＞S1株。H6株和S1株降解蛋白能力相似，且S1株降解酪蛋白能力最差。饲料样本经粗酶液酶解后，A7株试验组豆粕和玉米粉的降解率分别可达:53.13％和11.17％，比对照组提高了17.64％和7.49％;对豆粕和玉米粉的蛋白水解度(DH)为可达:28.06％和17.31％，比对照组提高了16.42％和8.44％。
　　利用菌株的DNA为模板，成功扩增并测序出菌株的蛋白酶基因，测序结果显示该片段大小均为1579bp，与部分芽孢杆菌属间的中性蛋白酶基因序列同源性达99％以上。三菌株间核苷酸编码区序列相似性为99.30％，推到出的氨基酸相似性为99.47％。酶结构预测表明，三株菌株的中性蛋白酶均为分子量中等大小，性质稳定的α/β型蛋白。
　　本研究表明，来源于鱼、猪和鸡的枯草芽孢杆菌在培养条件以及对饲料蛋白降解上有明显的差异。从编码蛋白酶基因的核酸序列及推出的氨基酸序列和酶分子大小看，三菌株之间蛋白酶基因序列同源性较高，均属于中性蛋白酶范畴，一级结构存在8个氨基酸位点差异，蛋白酶空间结构较为一致，然而从蛋白酶功能上看，A7株蛋白酶降解力远远高于H7和S1株。因此推测，导致三株菌在降解饲料蛋白能力的差异主要是因编码菌株蛋白酶的核酸序列的不同所致，由此推导出的这8个氨基酸差异位点正是影响酶功能的关键性位点。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 微生态制剂的应用背景

1．2 微生态制剂的定义及分类

1．2 微生态制剂发酵饲料研究进展

1．4 枯草芽孢杆菌的作用机理

1．4．1 提高饲料的营养价值

1．4．2 发酵脱霉、脱毒、去除抗性因子

1．4．3 增强动物免疫力

1．4．4 强化有益菌，抑制病原菌

1．4．5 改善饲料品质

1．4．6 生态效益和经济效益

1．5 固态发酵和液态发酵

1．5．1 液体深层发酵

1．5．2 固体发酵

1．6 枯草芽孢杆菌发酵饲料的临床应用效果

1．6．1 在猪饲料中的应用

1．6．2 在禽饲料中的应用

1．6．3 在水产动物饲料中的应用

1．7 影响微生物降解饲料的因素

1．7．1 菌种的选择

1．7．2 饲料蛋白结构

1．7．3 发酵工艺条件

1．7．4 发酵基质的性质

1．8 微生物发酵饲料的局限

1．8．1 携带并转移抗性基因

1．8．2 微生物安全性

1．8．3 发酵饲料添加量

1．8．4 完善行业检测标准

1．9 本试验的目的与意义

2．试验材料

2．1 试验菌株与饲料原料

2．2 主要培养基

2．3 主要试剂和药品

2．4 试验仪器设备

3．试验方法

3．1 菌株的优化培养

3．1．1 菌株的复苏、复壮

3．1．2 最适温度的确定

3．1．3 最适PH的确定

3．1．4 活菌计数

3．2 固体发酵正交试验

3．3 菌粉保存试验

3．3．1 菌粉制作

3．3．2 菌株复活试验

3．3．3 芽孢计数

3．4 菌株降解蛋白质的能力

3．4．1 产蛋白质酶能力鉴定

3．4．2 粗酶液提取

3．4．3 酶解产物的制备

3．4．4 检测菌株降解蛋白的能力

3．4．5 检测菌株降解饲料的能力

3．5 编码蛋白酶基因的研究

3．5．1 菌株培养

3．5．2 菌株基因组DNA的提取

3．5．3 PCR特异性扩增

3．5．4 PCR产物的克隆与序列分析

3．6 数据分析

4．试验结果

4．1 菌株的优化培养

4．1．1 培养温度的优化结果

4．1．2 培养pH的优化结果

4．2 固体发酵正交试验

4．3 菌粉保存试验

4．4 菌株降解蛋白质能力

4．4．1 菌株产蛋白酶能力试验

4．4．2 菌株降解蛋白试验

4．4．3 菌株降解饲料试验

4．5 编码蛋白酶基因的研究

4．5．1 PCR特异性扩增结果

4．5．2 阳性克隆产物的PCR鉴定结果

4．5．3 蛋白酶基因序列分析

4．5．4 蛋白序列分析

5．讨论

5．1 益生菌培养条件的优化

5．2 固体发酵正交试验

5．3 微生态制剂保存问题

5．4 菌株降解蛋白质能力

5．4．1 降解底物的选择

5．4．3 菌株对蛋白的降解能力

5．5 蛋白酶基因结构分析

5．5．1 中性蛋白酶基因序列的分析

5．5．2 中性蛋白酶的结构预测

6．结论与建议

7．本论文的创新之处

参考文献

致谢

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