兔MSTN,Ankrd2对骨骼肌卫星细胞分化影响及PGAM2,XKR4基因与家兔生长性状关联分析

摘要

肌肉生成抑制素(MSTN)基因是控制肌肉生长发育的负调控因子，调节着畜禽产肉量，同时还发现其对成肌细胞分化为肌管的过程产生抑制作用;骨骼肌锚定重复蛋白2(Ankrd2)为骨骼肌中特异性表达的基因，参与到细胞增殖和凋亡调控以及控制着肌肉生长、肥大过程，在骨骼肌生长发育过程中发挥着重要的作用。本研究选取出生后1d的新西兰幼兔为实验材料，分离、纯化家兔骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells，SCs)，采用siRNA介导的MSTN和Anrkd2基因沉默表达，研究其在家兔SCs增殖和分化过程中发挥的作用。
　　磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)是糖酵解和糖异生的关键酶，在调节能量代谢活动和动物生长发育中起着重要作用。XKR4基因（Kell血型复合物的亚单元相关家组成员4）在生物体内参与多种生物学过程，被认为是影响动物采食量、脂肪沉积、生长速度的重要候选基因。本试验选取天府黑兔、伊拉兔、香槟兔和新西兰兔为试验材料，检测PGAM2和XKR4基因CDS区遗传变异，采用PCR-RFLP和HRM技术对突变位点进行分析，并将遗传变异与家兔部分生长性状进行相关性分析。主要结果如下:
　　(1)取出生1d的新西兰白兔后腿肌肉组织，采用酶消化法分离、提取，差速贴壁法纯化兔骨骼肌卫星细胞(SCs)。通过细胞形态学观察和细胞表面标志物检查相结合对细胞进行鉴定。将分离的细胞培养发现，在各个培养阶段，细胞的形态学变化均符合卫星细胞各阶段特征;选取传至第二代的细胞，通过免疫组化检测SCs标志物Desmin蛋白，发现细胞中Desmin呈阳性表达。这些结果表明本试验所分离、纯化得到的细胞为骨骼肌卫星细胞。
　　(2)针对MSTN和Anrkd2基因，分别采用特异的siRNA序列si-MSTN-01、si-MSTN-02、si-MSTN-03和si-A nkrd2-01、si-Ankrd2-02、si-Ankrd2-03转染至第二代的SCs，通过实时荧光定量PCR检测转染组和对照组在转染24、48和72h后MSTN和Ankrd2基因mRNA的相对表达量。结果发现所有的细胞在转染siRNA48h后对靶基因沉默效率均高于24h和72h。si-MSTN-02转染48h为最佳序列和时间组合，对MSTN沉默效率最高，约为66％; si-Ankrd2-01转染48h为最佳序列时间组合，对Ankrd2沉默效率最高，约为69％。
　　(3)选取培养传代至第二代的兔SCs进行转染实验，选用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒通过酶标仪分别检测其在转染si-MSTN-0248h和si-Ankrd2-0148h对细胞增殖能力的影响。结果MSTN基因被抑制表达后，显著性促进了细胞的增殖能力(P＜0.05)，Ankrd2基因被抑制表达后，极显著促进了细胞的增殖能力(P＜0.01)。表明MSTN和Anrkd2基因参与到调控细胞的增殖过程，并起到抑制作用。
　　(4)采用实时荧光定量PCR的方法，检测SCs分化标志物myoD和Caveolin-3基因mRNA表达情况，结果显示，传至第二代的兔SCs，采用si-MSTN-02转染48h后，MyoD、Caveolin-3表达量显著性上升;采用si-Ankrd2-01转染48h后，MyoD、Caveolin-3表达量也有明显提高。结果MSTN、Ankrd2基因抑制表达后细胞分化为肌管的能力增强，表明MSTN和Ankrd2基因对肌管分化过程起到抑制作用。
　　(5)在PGAM2基因CDS区内共检测到3个SNPs，分别为:c.-10C＞T，c.195 C＞T和c.414+17C＞T。经分析发现位于外显子2内的c.195C＞T属于同义突变，对该位点采用PCR-RFLP的技术进行基因型分型并与生长性状及部分屠宰性状进行关联性分析，结果发现:PGAM2基因c.195C＞T位点CT基因型与家兔84日龄体重(W84)显著性相关(P＜0.05)，与35到84日龄平均日增重(ADG)极显著相关(P＜0.01)。
　　(6)在XKR4基因CDS区内共检测到3个SNP位点，分别为:c.804-8C＞T，c.1668C＞T和c.1698C＞T，位于编码区的两个SNP位点（c.1668C＞T和c.1698C＞T）均未引起氨基酸改变，属于同义突变，选取小样本直接测序发现二者完全连锁，对其采用HRM技术进行基因型分型并与生长性状进行关联性分析，结果发现:XKR4基因c.1668C＞T和c.1698C＞T位点与70日龄体重(W70)显著性相关(P＜0.05)，与35到70日龄平均日增重(ADG)极显著相关(P＜0.05)。
　　本试验通过对MSTN和Ankrd2基因沉默表达的研究，发现MSTN和Ankrd2基因会抑制SCs的增殖、分化，这为进一步研究MSTN和Ankrd2基因在骨骼肌细胞生长发育方面的作用提供参考。家兔PGAM2和XKR4基因CDS区的SNPs与生长速度相关，PGAM2和XKR4基因可作为影响家兔生长性状的重要候选基因，为采用分子育种提高家兔生产性能提供理论依据。

目录

论文说明

声明

摘要

1 文献综述

1．1 概述

1．2 动物骨骼肌生长发育

1．2．1 肌肉组成及其发育特征

1．2．2 肌纤维的类型及其之间的相互转化

1．2．3 肌纤维类型与肉质的关系

1．3 骨骼肌卫星细胞

1．3．1 骨骼肌卫星细胞简介

1．3．2 骨骼肌卫星细胞的分离方法

1．3．3 骨骼肌卫星细胞鉴定

1．4 骨骼肌生长发育过程中的重要转录因子

1．4．1 MRFs家族

1．4．2 肌肉生成抑制素

1．4．3 肌锚定重复蛋白家族

1．5 PGAM2基因

1．6 XKR4基因

1．7 研究目的及主要试验内容

1．7．1 本试验目的意义

1．7．2 本试验主要内容

2 试验材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物选择与组织采集

2．1．2 主要设备及器材

2．1．3 主要试剂及配制

2．1．4 主要器械消毒及清洗处理

2．2 试验方法

2．2．1 新西兰兔SCs分离、纯化及培养

2．2．2 siRNA合成及转染细胞

2．2．3 基因组DNA提取及纯度检测

2．2．4 PGAM2，XKR4基因变异位点检测

2．2．5 PGAM2，XKR4基因靶SNPs位点与生长性状关联性分析

3 试验结果与分析

3．1 MSTN，Ankrd2对兔骨骼肌卫星细胞分化影响

3．1．1 兔SCs的提取、纯化及培养

3．1．2 兔SCs鉴定

3．1．3 荧光定量PCR筛选干扰率最高的siRNA序列

3．1．4 转染siRNA后SCs的增殖能力检测结果

3．1．5 转染后SCs的分化能力检测结果

3．2 PGAM2，XKR4遗传多态性及其与家兔生长性能的关联分析

3．2．1 耳组织基因组DNA提取

3．2．2 家兔PGAM2基因遗传多态性

3．2．3 家兔XKR4基因遗传多态性

4 讨论

4．1 兔SCs细胞分离培养及纯度鉴定

4．2 MSTN，Ankrd2对兔SCs增殖分化的影响

4．3 PGAM2基因与家兔生长性状相关性

4．4 XKR4基因与家兔生长性状相关性

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表文章情况