大熊猫IFn-γ聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球的制备

摘要

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca），我国特有珍稀野生动物，属国家一级濒危保护物种。随着近年来圈养大熊猫的增多，增加了熊猫与人类“亲密接触”的机会，使得大熊猫疫病的流行背景变得愈加复杂，病毒性疾病发病率逐渐上升。干扰素γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是细胞因子家族的重要成员，主要由自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞分泌，是Ⅱ型免疫干扰素的唯一成员。干扰素γ能够调节巨噬细胞、T/B细胞间的关系，增强免疫应答，还具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性;广泛应用于多种疾病的预防和治疗。但其在体内半衰期短、易发生酶解，需频繁给药。高分子纳米载药系统是近几十年研发的新型给药系统，既可以增加药物的穿透力、靶向性和稳定性，又能保护蛋白类药物免遭破坏，延长药效。其中聚氰基丙烯酸正丁酯（Polybutylcyanoacrylate，PBCA）是一种极富潜力的纳米载药材料，拥有良好的生物相容性和可降解性，没有免疫原性，安全性高。
　　本试验选取PBCA作为载体材料，大熊猫干扰素γ为药物模型，制备纳米球（IFNγ-PBCA-NS），以期优选出最佳的制作工艺，为进一步研究包封大熊猫多肽类药物微粒提供参考依据，为大熊猫疾病诊疗提供新的思路，主要结果如下:
　　1.本试验从刀豆凝集素A诱导的大熊猫外周血淋巴细胞中提取总RNA，成功扩增出大熊猫IFN-γ基因。结果显示所得IFN-γ基因共465 bp，与GenBank中的大熊猫IFN-γ基因相比较，匹配率达96％～99％，没有缺失变异等情况。再将测序成功的产物连接到原核表达载体上，利用大肠杆菌系统进行培养。经IPTG诱导的重组蛋白约33.5 kD，主要以包涵体的形式存在。采用Ni柱亲和层析柱纯化蛋白，并梯度透析复性，经核酸蛋白酶仪测定，蛋白浓度为0.46 mg/mL。采用VSV-WISH系统测定干扰素的抗病毒活性，结果为3.2×105 U/mg。
　　2.采用乳化聚合法制备IFNγ-PBCA-NS结果显示，所得纳米球为骨架型纳米球，经电镜观察纳米球外观规整，粒径在50nm～200nm之间，跨距0.55，大小较均匀，包封率为56.7％，载药量为0.86％。在优化纳米球制备条件试验中，确定pH值6～6.5、BCA用量5～10 g/L、poloxamer188用量5～10 g/L、IFN-γ用量小于0.8 g/L的条件范围内均有利于纳米球的制备，不易出现粘连、分散不均等情况。小鼠药效试验结果表明，sc-IFNγ-PBCA-NS组生命延长率（RLML）最显著，IFNγ-PBCA-NS组整体效果优于IFN-γ组。SPSS软件方差分析，可得ig-IFN-γ组与ig-IFNγ-PBCA组的RLML差异极显著(P＜0.01); sc-IFN-γ组与sc-IFNγ-PBCA组RLML差异显著(P＜0.05)。说明包被后的IFN-γ在体内抗病毒作用增强，采用PBCA为载药材料制备的大熊猫IFN-γ纳米球具有一定的缓释作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 大熊猫疾病研究概况

1．1 病毒性疾病

1．2 寄生虫疾病

2 干扰素研究概况

2．1 干扰素的发现

2．2 干扰素γ的产生与结构

2．3 干扰素γ的受体及信号传导

2．4 干扰素γ的主要生物活性

2．5 长效干扰素的研究情况

3 PBCA-NS载药系统研究概况

3．1 制作工艺

3．2 PBCA-NS载药系统的应用

3．3 毒理学研究

4 研究目的和意义

第二章 IFNγ的原核表达

1 实验材料

1．1 载体、菌株和细胞

1．2 实验动物

1．3 实验仪器

1．4 试剂与配制

2 实验方法

2．1 干扰素γ克隆载体的构建

2．2 干扰素γ原核表达载体的构建

3 结果与分析

3．1 干扰素γ克隆载体的构建

3．2 干扰素γ原核表达载体的构建

4 讨论

4．1 原核表达系统

4．2 包涵体蛋白的纯化与复性

第三章 干扰素γ纳米球的制备

1 实验材料

1．1 病毒与细胞

1．2 实验动物

1．3 实验仪器

1．4 试剂与配制

2 实验方法

2．1 纳米球的制备

2．2 纳米球的质量评价

2．3 纳米球的药效测定

3 结果与分析

3．1 IFNγ-PBCA-NS的制备

3．2 纳米球的包封率与载药量

3．3 纳米球的表征

3．4 纳米球药效测定结果

4 讨论

4．1 大熊猫IFN-γ纳米球的制备情况

4．2 纳米球制备的影响因素

4．3 冻干保护剂

4．4 纳米球的表征

4．5 纳米球的药效

全文总结

参考文献

致谢

附件