林麝源铜绿假单胞菌外膜蛋白的提取及免疫原性的研究

摘要

铜绿假单胞杆菌一直以来是困扰野生动物养殖的一大难题，属较难防控的细菌性疾病之一。该菌具有较强的耐药性，感染机体后，可产生多种毒力因子，其具有很强的致病作用，单独使用抗生素的治疗效果并不理想，这限制了抗生素的广泛使用。因此，合理的疫苗接种对该疫病的预防起着至关重要的作用。目前，我国还没有针对铜绿假单胞菌病的有批文的疫苗。本研究根据林麝养殖场铜绿假单胞菌的分布情况，通过动物攻毒试验，成功筛选出了一株毒力最强的菌株作为试验菌株。经提取和纯化该菌株的外膜蛋白，并进行免疫接种，从细胞免疫、体液免疫和攻毒保护三个方面来评估该菌株的免疫原性，并对免疫效果进行评价，以期为林麝铜绿假单胞菌病的防控提供参考依据。本文所开展的研究和取得的结果如下:
　　1.试验菌株的筛选
　　试验选取本实验室从林麝体内分离并保存的7株铜绿假单胞菌，并均用同一菌液浓度对试验小鼠进行攻毒，从中筛选出一株毒力最强的菌株（sp-19株），最终，测得其对小鼠的LD50是6.7114×106 CFU。
　　2.外膜蛋白的纯化及鉴定
　　通过试剂盒提取sp-19株的外膜蛋白。经SDS-PAGE电泳分析，显示该方法提取的外膜蛋白有8个蛋白条带，其分子量分别约为104 KD、71 KD、52 KD、43 KD、36 KD、22 KD、18KD和9KD。免疫印迹结果显示，这些外膜蛋白均能与抗铜绿假单胞菌sp-19株阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。
　　3.外膜蛋白免疫效果评价
　　分别将试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫实验小鼠。在四免后，采用间接ELISA的方法检测试验小鼠的抗体动态变化，结果显示，各抗原免疫组小鼠体内抗体滴度随免疫进程持续升高。其中，试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白抗原组小鼠的抗体水平最高，sp-19株全菌制备的免疫原组和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白抗原组次之，其效价分别达到1∶12500、1∶2500和1∶500。体外淋巴细胞增殖试验表明，sp-19株外膜蛋白能显著促进各抗原免疫组的小鼠T、B淋巴细胞的增殖，其增殖率分别为3.05、2.51和1.33;采用细胞因子检测试剂盒对免疫0、15、29、43和50天各抗原免疫组小鼠血液中的IL-4和IFN-γ进行检测，其含量最高达104 pg/ml、87 pg/ml、66 pg/ml和134 pg/ml、131 pg/ml和97 pg/ml。
　　4.外膜蛋白免疫保护性研究
　　分别用试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫小鼠，二免后用5倍LD50的sp-19株活菌经腹腔攻毒，结果显示，试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白保护率为87.5％，sp-19株全菌制备的免疫原保护率为62.5％，超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白保护率仅为12.5％，生理盐水对照组和佐剂对照全部死亡。被动免疫试验中，先分别将各抗原组免疫56天后的高免血清0.2 ml腹腔注射于小鼠体内，2h后用2倍LD50的铜绿假单胞菌sp-19株活菌经腹腔攻毒。结果显示，试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白保护率为100％，全菌制备的免疫原保护率为87.5％，超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白为仅25％，生理盐水对照组全部死亡。

目录

声明

摘要

符号说明

1 文章综述

1．1 铜绿假单胞菌病概述

1．1．1 病原学

1．1．2 感染现状

1．1．3 血清型

1．1．4 致病机理和病理变化

1．1．5 防制措施

1．2 我国林麝养殖现状

1．3 铜绿假单胞菌的主要免疫原及相关疫苗

1．3．1 磷酸脂多糖

1．3．2 菌毛及鞭毛

1．3．3 外毒素A

1．3．4 外膜蛋白

1．4 铜绿假单胞菌外膜蛋白的研究进展

1．4．1 铜绿假单胞菌OMP的结构与组成

1．4．2 铜绿假单胞菌OMP通透性与耐药性

1．4．3 铜绿假单胞菌OMP的免疫原性及保护性

1．4．4 铜绿假单胞菌OMP疫苗的应用前景

1．5 本研究的目的及意义

2 试验材料

2．1 供试菌株

2．2 试验动物

2．3 主要培养基及缓冲液

2．3．1 培养基等

2．3．2 SDS-PAGE及Western Blotting涉及溶液

2．3．3 ELISA涉及溶液

2．4 主要药品及试剂

2．5 试验仪器

3 试验方法

3．1 菌株的筛选、毒力的测定及兔抗铜绿假单胞菌全菌免疫血清的制备

3．1．1 菌株的筛选

3．1．2 铜绿假单胞菌半数致死量(LD50)的测定

3．1．3 兔抗铜绿假单胞菌全菌血清的制备及血清IgG的纯化

3．2 铜绿假单胞菌外膜蛋白的纯化及鉴定

3．2．1 增菌

3．2．2 收集菌体

3．2．3 超声破碎粗提取外膜蛋白

3．2．4 外膜蛋白的提取和纯化

3．2．5 外膜蛋白的SDS-PAGE分析

3．2．6 外膜蛋白免疫印迹分析(Western-blotting)

3．3 外膜蛋白免疫原性的研究

3．3．1 鼠抗血清的制备

3．3．2 间接ELISA的方法检测外膜蛋白主动免疫时抗体的动态变化

3．3．3 淋巴细胞增殖能力检测

3．3．4 外周血清中细胞因子含量检测

3．4 外膜蛋白保免疫护性的研究

3．4．1 外膜蛋白的主动免疫保护

3．4．2 外膜蛋白抗血清的被动免疫保护

4 试验结果

4．1 菌株筛选结果

4．1．1 动物致病性试验结果

4．1．2 目的菌株再分离结果

4．1．3 sp-19株半数致死量(LD50)的测定

4．1．4 组织切片观察

4．1．5 兔抗sp-19株全菌血清的制备及纯化

4．2 铜绿假单胞菌外膜蛋白的纯化及鉴定

4．2．1 外膜蛋白SDS-PAGE分析

4．2．2 外膜蛋白免疫印迹分析(Western-blotting)

4．3 外膜蛋白免疫原性的研究

4．3．1 灭活检验

4．3．2 间接ELISA方法检测外膜蛋白主动免疫时抗体的动态变化

4．3．3 淋巴细胞增殖能力检测

4．3．4 细胞因子含量检测

4．4 外膜蛋白免疫保护性的研究

4．4．1 外膜蛋白的主动免疫保护

4．4．2 外膜蛋白抗血清的被动免疫保护

5 讨论分析

5．1 菌株的筛选

5．2 铜绿假单胞菌外膜蛋白的纯化及鉴定

5．3 外膜蛋白免疫原性的研究

5．3．1 间接ELISA检测外膜蛋白的主动免疫时抗体的动态变化

5．3．2 淋巴细胞增殖能力检测

5．3．3 外周血清中细胞因子含量检测

5．3．4 外膜蛋白保免疫护性的研究

6 结论

7 创新性

参考文献

致谢