中药组方“乌黄虎”合剂的研制及其毒理学研究

摘要

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种呼吸系统疾病。该病具有高死亡，高传染，各阶段猪只均易感，常暴发流行等特点，临床上经常与多种病毒和细菌混合感染。该病临床上表现为急、慢性肺部炎症，引起呼吸系统功能障碍，最终导致死亡。目前临床上治疗猪传染性胸膜肺炎主要以西药为主，能起到很好的治疗效果，但西药在临床上的滥用，不仅造成耐药性、药物残留等问题，还可能在猪只生长过程中损害其脏器，影响生长发育。而中药证明了具有经济、低毒、无残留等优点，故本试验从20味中药中筛选出抗胸膜肺炎放线杆菌活性较强的几味中药，并进行联合抑菌试验，筛选出有相加和协同作用的中药组方并进行毒理学评价，为新兽药的研制提供理论和毒理学基础。本研究主要内容及结果如下:
　　1.20味中药有效成分的提取及其抗胸膜肺炎放线杆菌活性研究:采用乙醇回流、水煎煮、超声等方法对20味中药进行提取，将提取得到的中药浸膏进行体外抑菌试验，测出各味中药提取物抗胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitoryconcentration，MIC)和最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC）。同时，采用棋盘法对筛选出抗胸膜肺炎放线杆菌效果较好中药进行联合抑菌试验。结果显示:乌梅、黄连、诃子、秦皮、地榆、虎杖6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围是6.25～50.00mg/mL;大青叶、茵陈、甘草和白鲜皮4种中药提取物的MIC范围是50.00～100.00mg/mL;黄柏、杜仲、金银花、柴胡、蒲公英、板蓝根、栀子和黄芪等10种中药提取物的MIC＞100mg/mL。联合抑菌试验结果表明:乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合的抑菌指数（Fractional inhibitory concentration index，FICI）＜1，呈协同或相加作用;乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI＞2，呈无关作用。通过试验，对胸膜肺炎放线杆菌具有较好的体外抑菌效果的几味中药为:黄连、乌梅、虎杖、诃子、秦皮和地榆，同时乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合呈现协同或相加作用，最终筛选出黄连、乌梅和虎杖三种中药进行组方。
　　2.中药组方“乌黄虎”合剂中3味中药最佳提取工艺的研究:对筛选得到抗胸膜肺炎放线杆菌效果较好且具有联合作用的3种中药黄连、乌梅和虎杖进行最佳提取工艺研究，以浸膏得率、MIC和MBC之和作为评价指标，优选3味中药最佳提取工艺。结果表明，黄连最佳提取工艺为:将黄连粉碎成粗粉，以70％乙醇浓度作为溶剂（料液比1∶8），加热回流提取2次，每次2h;乌梅最佳提取工艺为:将乌梅粉碎成粗粉，以95％乙醇作为溶剂（料液比1∶10），90℃加热回流提取1次，每次8 h;虎杖最佳提取工艺为:将虎杖粉碎成粗粉，以60％乙醇作为溶剂（料液比1∶6），90℃加热回流提取3次，每次2h。在最佳提取工艺下，黄连、乌梅和虎杖三种提取物浸膏对胸膜肺炎放线杆菌的MIC值分别为15.60 mg/mL、10.40 mg/mL、15.60 mg/mL，MBC值分别为26.00 mg/mL、18.20 mg/mL、15.60 mg/mL，抑菌效果明显，表明优选得到的提取工艺稳定可行。
　　3.中药组方“乌黄虎”合剂的研制及其质量标准建立:通过组方前的初步筛选，选出组方的溶剂，增溶剂，防腐剂等辅料，再通过辅料对“乌黄虎”合剂澄明度、相对密度等影响确定辅料用量，最终筛选出组方合剂制备工艺;利用薄层色谱对3味中药原药材、提取浸膏、“乌黄虎”合剂和合剂阴性对照进行薄层色谱鉴定，确定原药材、浸膏及合剂是否符合药典规范;利用高效液相色谱分别对“乌黄虎”合剂中主药乌梅和虎杖主要成分枸橼酸和虎杖苷进行含量测定，建立系统的含量测定标准。结果表明:试验筛选得到的合剂制备工艺可行，澄明度、相对密度等药典规定项下检测项目均符合要求;薄层色谱结果表明，3味中药原材料和提取浸膏都符合药典规定，在同一条件下与对照品出现相应荧光斑点，“乌黄虎”合剂在3味中药薄层色谱图中与原材料和对照品出现相应斑点;高效液相色谱结果表明，在色谱条件为乙腈-0.5％磷酸二氢铵溶液(3∶97)（以磷酸调节pH值为3.0）为流动相，检测波长为210nm，柱温为25℃;流速为1.0 mL/min条件下，系统适应性良好，在此条件下，枸橼酸浓度在0.156 mg/mL～5.000 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，测定3批次“乌黄虎”合剂中枸橼酸含量平均值为14.73 mg/mL;在色谱条件为乙腈-水溶液(23∶77)为流动相，检测波长为306 nm，柱温为25℃，流速为1.0 mL/min条件下，系统适应性良好，在此条件下，虎杖苷浓度在6.25μg·mL-1～100.00μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，测定3批次“乌黄虎”合剂中虎杖苷含量平均值为1832.71μg·mL-1。结论:“乌黄虎”合剂制备工艺简单可行;组方3味中药原药材、提取浸膏符合药典规定;其质量标准在规定的范围内可控。
　　4.中药组方“乌黄虎”合剂的毒理学研究:根据兽药研究技术指导原则汇编，毒理学评价包括对中药组方“乌黄虎”合剂对大鼠灌胃急性毒性试验和中药组方合剂对大鼠灌胃30天亚慢性毒性试验。急性毒性试验表明，在给药剂量＞5000 mg/kg时，大鼠表现正常且无死亡，判定受试大鼠LD50＞5000 mg/kg，证明组方“乌黄虎”合剂为实际无毒物质。亚慢性毒性试验结果表明，“乌黄虎”合剂高剂量组(6.25 g/kg)、中剂量组(5.00 g/kg)、低剂量组(3.75 g/kg)大鼠连续30d灌胃给药后，未出现明显的毒性反应。试验组大鼠采食、饮水等均正常。给药后30d所测得大鼠的血液学指标与正常组对照并无明显差异，除低浓度剂量组“乌黄虎”合剂血液生化指标与正常对照组的一些指标有轻微的变化外，其余均无明显差异。各脏器组织病理学检查结果表明低剂量“乌黄虎”合剂可导致肝、肾、脾、肺、睾丸和卵巢发生可逆性变性变化。结论:“乌黄虎”合剂为无毒有效的新型中药组方制剂，该毒理学评价结果为该制剂的临床应用提够了理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述及研究目的

1 文献综述

1．1 胸膜肺炎放线杆菌研究概况

1．2 胸膜肺炎放线杆菌的危害

1．3 胸膜肺炎放线杆菌的防治

1．4 中草药与中药合剂研究进展

2 本试验研究的目的与意义

3 论文设计思路

第二章 中药有效成分的提取及其体外抗胸膜肺炎放线杆菌活性研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 20味中药提取物体外抑菌活性研究

2．2 5味中药提取物体外联合抑菌活性研究

3．讨论

4．小结

第三章 中药组方“乌黄虎”合剂中原药材的鉴定及最佳提取工艺研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 3味中药的薄层鉴定

2．2 3味中药最佳提取工艺结果分析

3 讨论

4．小结

第四章 中药组方“乌黄虎”合剂的研制及其质量标准研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 中药组方“乌黄虎”合剂制备工艺筛选

2．2 中药组方“乌黄虎”合剂的常规检查

2．3 中药组方“乌黄虎”合剂薄层鉴定

2．4 中药组方“乌黄虎”合剂含量测定

3 讨论

4 小结

第五章 中药组方“乌黄虎”合剂的毒理学研究

1 材料与方法

1．1 试验动物与药品

1．2 仪器设备

1．3 试验试剂

1．4 试验方法

2 结果与分析

2．1 中药组方“乌黄虎”合剂的急性毒性试验

2．2 中药组方“乌黄虎”合剂的亚慢性毒性试验

3 讨论

3．1 中药组方“乌黄虎”合剂急性毒性试验结果分析

3．2 中药组方“乌黄虎”合剂亚慢性毒性试验结果分析

4 小结

第六章 结论与创新

1．结论

2．创新

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

附图