不同年龄阶段山羊瘤胃古菌，细菌菌群结构组成研究

摘要

瘤胃微生物在维持反刍动物的健康和提高饲料利用效率方面起着重要的作用而且微生物菌群结构会随着年龄的变化而发生改变。但是现阶段关于瘤胃微生物随年龄发展变化的研究鲜见报道。为此，本实验以山羊为实验动物，提取瘤胃液总DNA，并利用高通量技术进行测序，旨在研究不同年龄阶段山羊瘤胃古菌，细菌菌群结构组成。
　　分别挑选1天、7天、15天、1月、2月、3月、4月、5月、6月龄、1岁、1.5岁和2岁十二个年龄组共60头健康的山羊作为实验动物，其中1天与2岁年龄组仅用于古菌菌群结构的研究，而其他年龄组用于研究古菌和细菌菌群结构。每个年龄组5头羊，所有动物按正常饲养管理程序饲养。除一日龄屠宰采样外，其余年龄组在清晨饲喂后1小时用胃管经食道插入瘤胃，利用真空泵压力装置吸取瘤胃内容物，抽取大于50ml的瘤胃内容物，经四层灭菌纱布过滤得瘤胃液，提取瘤胃液微生物总DNA，采用原核生物通用引物对515F/806R针对细菌16SrRNA的V4-V5可变区进行Barcode-PCR扩增，采用古菌特异性引物对349F/806R针对古菌16SrRNA的V3-V4可变区进行Barcode-PCR扩增，产物经检测后送千年基因生物技术公司用MiSeq测序平台进行高通量测序。后期数据分析主要用QIIME1.8.0软件进行分析，数据的差异显著性检验利用IBM SPSS Statistics22进行。
　　结果显示:(1)拟杆菌门(Bacteroidetes44.07％±0.09)，变形菌门(Proteobacteria16.97％±0.05)，厚壁菌门(Firmicutes9.45％±0.02)为各年龄组中优势菌群。拟杆菌门从7日龄到3月龄丰度逐渐升高，随后逐渐降低，6月龄以后达到稳定，而变形菌门(Proteobacteria)的变化趋势与之相反。古菌中广古菌门(Euryarchaeota84.02％±0.10)和泉古菌门(Crenarchaeota14.38％±0.10)为各年龄组中优势菌群。广古菌门(Euryarchaeota)从出生到15日龄丰度逐渐增加，之后丰度虽有波动但差异不显著(P＞0.05)，而泉古菌门(Crenarchaeota)的丰度在1日龄到15日龄变化与广古菌门(Euryarchaeota)相反，之后变化趋势一样。科分类水平上，普雷沃氏菌科（Prevotellaceae29.87％±0.16），未分类的拟杆菌目(Unclassified Bacteroidales5.60％±0.04)，地杆菌科（Geobacteraceae7.26％±0.07），肠杆菌科（Enterobacteriaceae4.44％±0.47）为各年龄组中优势菌群。普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)从7日龄到4月龄丰度逐渐增加，从4月龄到1.5岁丰度急剧降低。古菌中，甲烷菌科（Methanobacteriaceae44.91％±0.19），热原体科（Thermoplasmatales_incertae_se17.99％±0.11）为各年龄组中优势菌群，且都属于广古菌门(Euryarchaeota)。属分类水平上，普雷沃氏菌属(Prevotella23.72％±00.17)，地杆菌属（Geobacter5.60％±0.04），埃希式杆菌属（Escherichia/Shigella4.11％±0.05），Paraprevotella(1.70％±0.01)为各年龄组中优势菌群。普雷沃氏菌属(Prevotella)从出生到3月龄丰度逐渐增加，之后丰度逐渐降低。古菌中，甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter44.66％±0.19），Thermogymnomonas(17.99％±0.11)为各年龄组中优势菌群，且都属于广古菌门(Euryarchaeota)。(2)不同年龄组内Alpha多样性分析发现，7日龄组物种多样性较其它年龄组高。古菌中6月龄observed_species指数最高(170.6)，15日龄chao1指数最高(264.35)，1.5岁shannon指数最高(4.93)。(3)不同年龄组间Beta分析发现，1.5岁组内个体物种组成差异性最低（0.60±0.31），而3月龄组内个体物种组成差异性最高(0.76±0.39)。古菌中2岁组内个体间菌群组成的差异性最小（0.19±0.04），而五月龄组内个体间菌群组成的差异性最大（0.61±0.19）。(4)不同年龄组内细菌核心菌群(≥0.1％)进行统计分析发现，7日龄菌群共享属数量最多(79)，而不同组间共享属菌群仅有42个。古菌中，不同年龄组间的核心菌群只有甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter)和Thermogymnomonas。
　　综上所述，一些在成熟瘤胃中优势的菌群最早在出生后就被检测到，且他们(拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria、广古菌门Euryarchaeota和泉古菌门Crenarchaeota)的丰度从出生到成熟呈现规律性变化。同时，不同年龄组内个体的细菌菌群组成虽然在刚出生后一段时间差异较大，但在动物成熟时其个体菌群组成逐渐稳定（1.5岁），而古菌不同年龄组内个体菌群组成在5月龄之前差异较大，之后的菌群差异逐渐减小，趋于稳定。

目录

论文说明

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．瘤胃古细菌多样性概述

1．1 瘤胃微生物的发现

1．2 瘤胃细菌的分类

1．3 瘤胃古菌的分类

2．影响瘤胃微生物菌群的因素

2．1 日粮成份对瘤胃微生物多样性的影响

2．2 品种对瘤胃微生物多样性的影响

2．3 瘤胃液相固相对微生物多样性的影响

2．4 个体对瘤胃微生物多样性的影响

2．5 年龄对瘤胃微生物多样性的影响

2．6 其他因素对瘤胃微生物的影响

3．传统技术与现代分子生物学技术在瘤胃微生物多样性研究中的应用

3．1 传统培养技术

3．2 现代分子生物学技术

4．高通量测序

4．1 高通量测序平台

5．本研究的目的意义和主要内容

5．1 存在的问题

5．2 研究的目的与意义

5．3 主要内容

第二章：实验研究

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 瘤胃内容物的收集及总DNA提取

1．3 瘤胃古菌和细菌16S rRNA基因的扩增

1．4 数据分析

2．结果

2．1 测序结果统计

2．2 物种组成

2．3 Alpha多样性

2．4 Beta分析

2．5 核心菌群

3．讨论

3．1 物种组成

3．2 Alpha多样性

3．3 Beta分析

3．4 核心菌群

第三章：结论及创新点

1．结论

2．创新点

3．进一步的研究

参考文献

致谢

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