鹅等级前卵泡发育中的基因表达差异富集AKR1D1基因功能初探

摘要

鹅等级前卵泡的生长和发育直接影响鹅的产蛋性能，鹅在等级前卵泡中有两个特殊的阶段:卵泡的募集阶段(small white follicles，SWF，2-4mm)和优势卵泡的筛选阶段(smallyellow follicles，SYF，8-10mm)。这两个选择过程出现在不同的卵泡发育阶段，结果也大不相同，卵泡的募集可以选出大量的小卵泡一起进入下一阶段发育，而优势卵泡的筛选只能选出唯一一个卵泡。为了探究这两个阶段卵泡在鹅产蛋过程中基因差异性表达的分子网络机制，本实验分别以SWF和SYF两个阶段的鹅等级前卵泡为实验材料，进行Illumina/Solexa测序及数字基因表达谱(DGE)分析，以期对这两个阶段卵泡呈现差异性表达的基因进行鉴别及筛选，并对其进行GO分析和KEGGpathway分析;DGE测序结果表明，AKR1D1在小白卵泡和大黄卵泡中均有表达，且其表达存在显著差异，AKR1D1主要的生物功能是胆汁酸的合成和类固醇激素的清除，而类固醇激素的动态平衡是影响卵泡正常发育的关键，因此对AKR1D1基因在卵泡发育过程中的功能进行初步探索，主要研究结果如下:
　　1.在构建的SWF和SYF文库中分别检测到了1.59G和1.71G的数据，经过一些列质量控制过滤之后，得到了可信度较高的1.56G和1.68G的Clean序列。
　　2.利用RSEM软件，将SWF和SYF过滤后的测序序列分别进行基因组定位分析，两组所得定位百分比分别为88.80％和89.21％，均高于70％，表明结果较为理想。
　　3.通过DGE技术，本次在SWF和SYF两个阶段的卵泡组织中共检测到160个差异表达基因，其中有114个基因表达上调，46个基因表达下调。
　　4.通过对差异基因进行GO和KEGG Pathway富集，富集到了很多可以诠释SWF和SYF两个阶段卵泡发育差异的通路，比如细胞增殖、细胞分化、营养的传输、能量的供给、氨基酸代谢和脂质代谢等通路，而可以推断出其中的类固醇合成、细胞增殖和细胞分化过程在SWF卵泡发育阶段扮演着重要的角色。
　　5.本研究成功获得鹅AKR1D1基因的CDS区序列981bp，编码326个氨基酸。鹅与鸡、火鸡AKR1D1基因的氨基酸相似性均高于90％;鹅AKR1D1蛋白主要定位于细胞质和线粒体，不属于分泌蛋白，存在18个潜在磷酸化位点和3个糖基化位点，蛋白质三级结构呈弯曲螺旋状;qRT-PCR结果显示鹅AKR1D1在2-4mm卵泡颗粒层和膜层表达最高，在F5膜层和F1颗粒层中表达最低。

目录

论文说明

声明

摘要

主要符号说明

前言

1．文献综述

1．1 禽类卵泡发育的动态模式

1．1．1 原始卵泡库的建立

1．1．2 卵泡的募集

1．1．3 优势卵泡的选择

1．1．4 排卵

1．2 禽类卵泡发育特点及等级划分

1．2．1 禽类卵泡发育特点

1．2．2 禽类等级前卵泡发育特点

1．2．3 禽类卵泡的等级划分

1．3 AKR1D1在卵泡发育过程中的作用

1．3．1 AKR1D1的发现、结构、分布及功能

1．3．2 AKR1D1通过类固醇激素对卵泡发育的作用

1．4 研究的目的与意义

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 器材、试剂及相关软件

2．2 试验方法

2．2．1 样品的制备

2．2．2 数字基因表达谱的构建

2．2．3 DGE差异表达基因的验证

2．2．4 数据分析

2．2．5 AKR1D1基因CDS的扩增

2．2．6 AKR1D1编码区序列拼接

2．2．7 AKR1D1编码区序列生物信息学分析

2．2．8 AKR1D1在各个阶段卵泡颗粒层、膜层的荧光定量分析

3．结果与分析

3．1 SWF和SYF之间的基因表达差异富集

3．1．1 测序质量评估

3．1．2 SWF与SYF之间的差异表达基因

3．1．3 SWF与SYF之间的差异表达基因的GO和KEGG富集

3．1．4 差异表达基因验证

3．2 鹅AKR1D1基因生物信息学及在各级卵泡中的表达

3．2．1 鹅AKR1D1基因编码区cDNA的克隆

3．2．2 鹅AKR1D1基因CDS区相似区和系统发育树分析

3．2．3 AKR1D1蛋白结构分析

3．2．4 AKR1D1在鹅卵泡发育中的颗粒层和膜层的表达

4．讨论

4．1 鹅等级前卵泡发育中的基因表达差异富集分析

4．1．1 两个阶段鹅等级前卵泡的功能差异基因

4．1．2 两个阶段卵泡差异基因参与的分子过程

4．1．3 基于差异表达基因的主要信号通路

4．1．4 两个阶段卵泡差异基因富集分析的不足和后续改进

4．2 鹅AKR1D1基因生物信息学及在各级卵泡中表达分析

4．2．1 AKR1D1编码区序列生物学分析

4．2．2 AKR1D1在各个阶段卵泡膜层、颗粒层的定量分析

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间参与的科研项目和发表的学术论文